בדיקת אנזימים כרומוגנית בלתי מסיסה מבוססת ביומסה: בדיקה להערכת פעילות הפירוק של אנזימים מפרקים ביומסה צמחית

ביומסה היא חומר אורגני שמקורו בצמחים המורכב בעיקר מפוליסכרידים מורכבים. אנזימים מפרקי פחמימות פועלים על הפוליסכרידים הללו כדי לייצר אוליגוסכרידים קטנים יותר.

כדי להעריך את פעילות הפירוק של אנזים, התחל בלקיחת ביומסה כרומוגנית בלתי מסיסה - מצעי ICB הקיימים בבארות של צלחת תגובה נקבובית. מצעים אלה מתקבלים מצביעת חומרים שמקורם בצמחים עם צבע כלורוטריאזין בצבע ספציפי. לביומסה המתקבלת יש פוליסכרידים מורכבים מתויגים בצבע המשמשים כמצע לפעילות אנזימים.

כעת, הוסף תמיסת חיץ המכילה אנזים הידרוליזה של פחמימות. המאגר שומר על ה-pH לפעילות אנזימים אופטימלית. הניחו את צלחת התגובה על שייקר ודגרו. תסיסה מתמדת מאפשרת למולקולות האנזים להגיע לפוליסכריד המטרה במצע ICB.

במהלך הדגירה, האנזים ההידרוליזה מבקע קשרים גליקוזידיים קוולנטיים בתוך הפוליסכרידים ארוכי השרשרת. התגובה מייצרת אוליגוסכרידים מסיסים הקשורים למולקולות צבע, שנשארות בתמיסה.

עם השלמת ההשפלה, הנח את לוחית התגובה על גבי לוחית מוצר וצנטריפוגה את המכלול. במהלך הצנטריפוגה, התמיסה הצבעונית המכילה תוצרי תגובה, עוברת דרך המסנן בתחתית הצלחת ונאספת בצלחת המוצר. בעזרת קורא צלחות, רשום את ספיגת הסופרנטנט.

ערך ספיגה גבוה יותר מציין ייצור של מספר רב של אוליגוסכרידים המקושרים לצבע - מה שמעיד על יעילות האנזים בפירוק מצע ה-ICB.

כדי לבצע את הבדיקה הכרומוגנית עם ביומסה כרומוגנית בלתי מסיסה אדומה, או קש חיטה ICB, התחל בהוספת 200 מיקרוליטר של תמיסת הפעלה לכל באר של לוחית הבדיקה. לאחר מכן, דגרו את הצלחת בטמפרטורת החדר, ללא תסיסה למשך 10 דקות.

הסר את המייצב באמצעות 100 מיקרוליטר מים סטריליים כדי לשטוף את הבארות שלוש פעמים. לאחר מכן, הוסף 150 מיקרוליטר של מאגר נתרן אצטט 100 מילי-מולרי, pH 4.5 ו-5 מיקרוליטר של 10 יחידות למיליליטר של תמיסת אנדו-קסילנאז שונה.

מקם את לוחית המוצר מתחת ללוחית המצע כדי לאסוף כל דליפה פוטנציאלית מלוחית המצע במהלך הטלטול, ודגר את התגובה בטמפרטורת החדר וב-100 סל"ד למשך שעתיים.

לאחר הדגירה, הנח את לוחית ערכת הבדיקה, עם לוחית המוצר מתחתיה, בצנטריפוגה, וסובב כלפי מטה ב-2,700 x גרם למשך 10 דקות כדי להעביר את תוצר התגובה בבארות של לוחית המוצר.

בדוק שנפח הנוזל בכל באר זהה בערך. לאחר מכן, באמצעות קורא צלחות, קרא את הספיגה של לוחית האיסוף ב-517 ננומטר עבור קש חיטה ICB אדום.