בדיקת צביעה גרעינית דיפרנציאלית: בדיקה לקביעת ציטוטוקסיות מיטוקאן על ידי פרופידיום יודיד וצביעה כפולה של הוכסט

מיטוקנים הם סוג של תרופות המשפיעות באופן סלקטיבי על תפקוד המיטוכונדריה בתאי סרטן וגורמות לאפופטוזיס.

כדי לקבוע ציטוטוקסיות מיטוקנית, זרע תרחיף תאים המכיל תאי סרטן דביקים למחצה על צלחת מרובת בארות. טפלו בצלחת בתמיסה המיטוקנית הרצויה ודגרו.

מיטוקן נכנס לתא הסרטני כדי לשבש את פעילותו המיטוכונדריאלית ובסופו של דבר מוביל למוות של תאים בתאי סרטן רגישים למיטוקאן. טפל בתאים בתמיסת מכתים המכילה תערובת של צבע Hoechst ופרופידיום יודיד.

Hoechst, צבע פלואורסצנטי חדיר לממברנה, חודר לכל התאים ונקשר לאזור העשיר ב-AT, ומעניק פלואורסצנטיות כחולה לגרעינים של תאים חיים ומתים כאחד.

לעומת זאת, פרופידיום יודיד, צבע פלואורסצנטי אטום לממברנה, נכנס אך ורק לתאים המתים דרך החלקים הפגועים של הממברנות שלהם. הצבע משתלב בין בסיסי ה-DNA, ומעניק פלואורסצנטיות אדומה נוספת לתאים המתים. נוכחותם של שני הצבעים בגרעיני התאים האלה גורמת לתאים המתים להיראות סגולים.

צנטריפוגה את הצלחת במהירות נמוכה כדי ליישב את התאים לדיוק משופר במהלך ההדמיה. צלמו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, והתבוננו בשתי אוכלוסיות תאים נפרדות. ספור את המספר של שני סוגי התאים.

אחוז התאים הסגולים המייצגים את אוכלוסיית המתים בהשוואה לכלל האוכלוסייה מצביע על הפוטנציאל הציטוטוקסי של מיטוקאן הבדיקה.

התחל בהכנת תמיסות של התרכובות המעניינות בריכוז הרצוי. הקפד תמיד לערבב תרכובות על ידי מערבולת יסודית.

כדי למדוד ציטוטוקסיות של תרכובת בודדת, הכינו תרכובות בריכוז סופי פי 2. אם מודדים ציטוטוקסיות של שילובי תרכובות, הכינו אותם בריכוז סופי פי 4.

הכן בקרות ממס בלבד על ידי ערבוב אותה כמות ממס עם המדיום המתאים. אוספים תאים לצינור חרוטי של 15 מיליליטר, ולוקחים 10 מיקרוליטר מתרחיף התא לצביעה כחולה טריפאן. הוסף 10 מיקרוליטר של 0.4% טריפן כחול לאליקווט, והשתמש בהמוציטומטר או במונה תאים כדי לספור תאים ברי קיימא ולא ברי קיימא.

תאי גלולה בצינור של 15 מיליליטר ב-200 x גרם למשך 5 דקות, לאחר מכן, שואבים או שופכים את הסופרנטנט. השעו מחדש את גלולת התא במדיה מתאימה לבדיקה בצפיפות תאים של 3x10⁵ תאים למיליליטר. השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי לזרוע 50 מיקרוליטר של תרחיף תאים לכל באר של צלחת של 96 בארות.

לבדיקות תרכובת בודדת, הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת תרכובת 2X לכל באר. עבור בארות בקרת ממס, הוסף 50 מיקרוליטר של אמצעי בדיקה המכילים את הממס בריכוז פי 2. לבדיקות שילוב, הוסף 25 מיקרוליטר מכל אחת מתרכובות 4X לכל באר. עבור בארות בקרת תרכובות בודדות, הוסף 25 מיקרוליטר כל אחת מתמיסת תרכובת 4X ומדיום בדיקה. ודא שהריכוז הסופי של DMSO אינו עולה על 0.5%.

כדי להבטיח את יכולת השחזור, הוסף תרופות כאשר קצה הפיפטה נוגע בצד הבארות, והקפד להוסיף את התרופות למקומות שונים. שלב זה צריך להתבצע במהירות רבה, רצוי שייקח לא יותר מ -30 דקות לצלחת.

הקש בעדינות על הצלחת כדי לערבב את תכולת הבארות, ודגירה בחום של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.

כאשר מוכנים לצבוע את התאים עם Hoechst 33342 ופרופידיום יודיד, הכינו תמיסת צביעה טרייה פי 10, והוסיפו 10 מיקרוליטר לכל באר. הקישו בעדינות על הצלחת, ודגרו אותה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.

צנטריפוגה את הצלחת בחום של 200 x גרם למשך 4 דקות כדי להביא את כל התאים לתחתית הצלחת. לאחר מכן, נגב בזהירות את תחתית הצלחת עם מודעהamp מגבון מעבדה כדי להסיר כל פסולת שעלולה להפריע להדמיה. צלם את הצלחת תוך 15 דקות לאחר הצנטריפוגה.