$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
במהלך מצבים פתולוגיים מסוימים, אריתרוציטים או תאי דם אדומים עוברים התכווצות תאים המלווה בטרנסלוקציה של פוספוליפיד הממברנה - פוספטידילסרין - מעלון הממברנה הפנימי לחיצוני, מה שמוביל למוות תאי מתוכנת, אריפטוזיס, המעורר פגוציטוזיס תאים בתיווך מקרופאגים.
כדי למדוד אריפטוזיס המושרה על ידי יונופור באוכלוסיית אריתרוציטים אנושית מבודדת באמצעות מבחן מחייב Annexin V, התחל עם אריתרוציטים תלויים במאגר נטול גלוקוז.
דלדול הגלוקוז גורם ללחץ תאי, ומפעיל חלבון ציטוזולי קינאז C, אשר לאחר מכן מפעיל תעלות סידן וגורם לזרם יוני סידן. יתר על כן, תעלות אשלגן מופעלות, מה שגורם לפליטת אשלגן והתכווצות תאים.
לאחר מכן, הוסף יונופור סידן היוצר קומפלקס יציב עם יוני סידן חוץ-תאיים. הקומפלקס מקל על כניסה ציטוזולית של יוני סידן על פני קרום התא, ומגדיל עוד יותר את ריכוז הסידן התוך תאי. זה, בתורו, מפעיל סקרמבלאז - טרנספורטר פוספוליפידים דו-כיווני - המסייע בהעברה של פוספטידילסרין מעלון קרום התא הפנימי לחיצוני, מפחית אסימטריה בקרום וגורם לאריפטוזיס.
צנטריפוגה אריתרוציטים שטופלו ביונופור. השעו מחדש את התאים במאגר מחייב המכיל סידן. הוסף תמיסת Annexin V מצומדת בצבע פלואורסצנטי.
החלבון קושר הפוספוליפידים התלוי בסידן, Annexin V, בעל זיקה גבוהה של פוספטידילסרין נקשר לשאריות הפוספטידילסרין החשופות בעלון קרום התא החיצוני
.
באמצעות מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנט, הפרד את אוכלוסיית האריתרוציטים על סמך עוצמת הקרינה של Annexin V. אריתרוציטים אריפטוטיים מציגים עוצמת פלואורסצנטית גבוהה יותר של Annexin V מאשר אריתרוציטים בריאים.
יש לדלל 2 מיליליטר של מאגר הקישור 5X Annexin V ב-8 מיליליטר PBS כדי לקבל מאגר מחייב 1X. השעו מחדש את כדורי התאים שטופלו ביונומיצין ולא טופלו במיליליטר אחד של מאגר הקישור 1X.
קח 235 מיקרוליטר של מתלי התאים במאגר הקשירה, והוסף 15 מיקרוליטר של מצומד Annexin V-Alexa Fluor 488 בצינור מיקרו-צנטריפוגה. דגרו את התאים בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות במקום חשוך.
צנטריפוגה בחום של 700 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את ה-supernatant. שטפו את התאים פעמיים עם מאגר מחייב 1X על ידי השעיית כדור התא ב-1.5 מיליליטר של מאגר הקשירה, וצנטריפוגה ב-700 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את כדורי התא ב-250 מיקרוליטר של מאגר מחייב 1X למדידות זרימה ציטומטרית. כעת, העבירו 200 מיקרוליטר של אריתרוציטים מוכתמים ב-Annexin V לצינורות פוליסטירן תחתונים עגולים של 1 מיליליטר התואמים לציטומטריית זרימה.
היכנס לתוכנת ציטומטריית הזרימה ולחץ על כפתור 'ניסוי חדש'. לחץ על כפתור 'צינור חדש', בחר את 'גיליון גלובלי' ובחר 'החל ניתוח' כדי למדוד את עוצמת הקרינה באורך גל עירור של 488 ננומטר ואורך גל פליטה של 530 ננומטר.
הגדר את מספר התאים ל-20,000 שייאספו לניתוח מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות. בחר את הצינור הרצוי ולחץ על כפתור 'טען'. לחץ על כפתור 'הקלט' למדידות פיזור קדימה ופיזור צדדי. חזור על הפעולה עבור כל הדגימות.
לחץ לחיצה ימנית על כפתור 'דגימה' ולחץ על 'החל ניתוח אצווה' כדי ליצור את קובץ התוצאות. לחץ לחיצה ימנית על כפתור 'דגימה' ולחץ על 'צור קבצי FSC'.