בדיקת דלדול גלוקוז במבחנה: שיטה מבוססת פלואורסצנטיות לכימות ספיגת גלוקוז בתאים באמצעות מדידת דלדול גלוקוז חוץ-תאי

גלוקוז, מקור אנרגיה תאי עיקרי, נכנס לתאים דרך חלבוני טרנספורטר גלוקוז בקרום התא. גלוקוז מתפרק בציטופלזמה של התא כדי לפירובאט, דרך המסלול הגליקוליטי, ומייצר אנרגיה באמצעות אדנוזין טריפוספט, או ATP, לחילוף חומרים תאי.

כדי למדוד את ספיגת הגלוקוז התוך תאית, התחל בתרבית דבקה של פיברובלסטים בצלחת מרובת בארות. החלף את המדיה במדיה נטולת גלוקוז ודגר. התאים מפרקים את הגלוקוז הזמין כדי לייצר אנרגיה, ומגיעים למצב רעב לגלוקוז.

החלף את המדיה בקבוצה אחת של בארות במדיה נטולת גלוקוז המכילה אינסולין, ממריץ ספיגת גלוקוז ודאוקסיגלוקוז פלואורסצנטי, אנלוגי גלוקוז. טפל בקבוצה אחרת של בארות במדיה נטולת גלוקוז המכילה דאוקסיגלוקוז פלואורסצנטי.

במהלך הדגירה, אינסולין ממריץ את ההעברה של מובילי גלוקוז נוספים לקרום הפלזמה, מה שמקל על ספיגה מוגברת של דאוקסיגלוקוז פלואורסצנטי, בהיעדר גלוקוז.

דאוקסיגלוקוז עובר זרחן ואינו עובר חילוף חומרים נוסף על ידי התאים. במקביל, הריכוז החוץ-תאי של דאוקסיגלוקוז פלואורסצנטי יורד.

לאחר הדגירה, אסוף את המדיה המכילה דאוקסיגלוקוז פלואורסצנטי שאינו מנוצל. טפל בתאים באמצעות מאגר ליזה. חומר הניקוי במאגר יוצר מיצלות וממיס את ממברנות התאים, וגורם לשחרור תוכן תוך תאי.

בעזרת קורא מיקרו-צלחת, מדוד את הקרינה של התא הומוגנאט המכיל דאוקסיגלוקוז פלואורסצנטי תוך-תאי ומדיה המכילה דאוקסיגלוקוז פלואורסצנטי חוץ-תאי שאינו מנוצל.

פיברובלסטים מגורים באינסולין מציגים ספיגת דאוקסיגלוקוז פלואורסצנטית תוך תאית מוגברת וירידה מקבילה בדאוקסיגלוקוז פלואורסצנטי חוץ-תאי בהשוואה לתאים לא מגורים.

השתמש ב-8 שכפולים עבור כל תנאי הדמיה. לכן, הכינו 1 מיליליטר לכל תנאי סימולציה.

השתמש ב-7 תנאי סימולציה ללא אינסולין: FD-גלוקוז של 2.5 מיקרוגרם למיליליטר, 1 מיקרוגרם למיליליטר, 0.5 מיקרוגרם למיליליטר, 0.2 מיקרוגרם למיליליטר, 0.1 מיקרוגרם למיליליטר, 0.05 מיקרוגרם למיליליטר ו-0 מיליגרם למיליליטר בצלחת אחת של 96 בארות.

השתמש ב-7 מצבי גירוי עם אינסולין: FD-גלוקוז של 2.5 מיקרוגרם למיליליטר, 1 מיקרוגרם למיליליטר, 0.5 מיקרוגרם למיליליטר, 0.2 מיקרוגרם למיליליטר, 0.1 מיקרוגרם למיליליטר, 0.05 מיקרוגרם למיליליטר ו-0 מיקרוגרם למיליליטר בצלחת נוספת של 96 בארות.

כדי להכין תנאי גירוי, יש לדלל 1 מיקרוליטר של 5 מיליגרם למיליליטר תמיסת עבודה FD-גלוקוז ו-999 מיקרוליטר של DMEM ללא גלוקוז כדי לקבל 1 מיליליטר של תמיסת מלאי עבודה.

באמצעות תמיסת מלאי עבודה זה, הכינו דילולים של 1:2000, 1:5000, 1:10000, 1:25000, 1:50000 ו-1:100,000 של גלוקוז FD כדי לקבל 2.5 מיקרוגרם למיליליטר, 1 מיקרוגרם למיליליטר, 0.5 מיקרוגרם למיליליטר, 0.2 מיקרוגרם למיליליטר, 0.1 מיקרוגרם למיליליטר, 0.05 מיקרוגרם למיליליטר בצינורות של 2 מיליליטר מיד לפני ניסויים בארון בטיחות ביולוגית ללא אורות. הוסף 1 מיקרוליטר אינסולין לכל אחד מהמצבים הללו.

לאחר 40 דקות של דגירה, יש לשפוך את ה-DMEM נטול הגלוקוז מכל באר בצלחות של 96 בארות, ולספוג את הנוזל הנותר במגבות נייר סטריליות. הוסף 100 מיקרוליטר כל אחד מתנאי הטיפול השונים שתוארו קודם לכן, לבארות לאורך עמוד אחד, ו-100 מיקרוליטר מאותו מצב טיפול לבארות לאורך השורה בשתי צלחות 96 הבארות. סמן את הלוחות שניצלו את התנאים עם ובלי אינסולין.

הוסף DMEM נטול גלוקוז בלבד לבארות הבקרה. דגרו את הצלחת למשך 40 דקות בחממת תרבית תאים בחושך.

לאחר גירוי התאים במשך 40 דקות, העבירו את אמצעי הגירוי משתי הלוחות ללוחות חדשים של 96 בארות, תוך שמירה על אותה פריסת ניסוי. שוטפים את התאים עם PBS. הסר PBS ושפך את כל התמיסה שנותרה על מגבות נייר סטריליות.

הוסף מעכב פרוטאז למאגר בדיקת הרדיו-אימונו-משקעים כדי להגן על חלבונים. מניחים צלחות המכילות בדיקת משקעים רדיו-אימונולוגיים בשייקר למשך 30 דקות.

באמצעות קורא מיקרו-פלטות, מדוד את הקרינה באורכי גל עירור ופליטה של 485 ו-535 ננומטר בהתאמה, ראשית, בתווך המכיל FD-גלוקוז חוץ-תאי, ולאחר מכן, הצלחת עם תאים שעברו בדיקת רדיו-אימונו-משקעים בתום 30 דקות דגירה.