מדידת דלדול אנלוגי של גלוקוז פלואורסצנטי חוץ-תאי: טכניקת מדידה חלופית להערכת ספיגת גלוקוז באיברי עכבר Ex Vivo

ברקמות, גלוקוז חוץ-תאי נכנס לתאים באמצעות דיפוזיה קלה באמצעות מובילי גלוקוז ספציפיים.

גלוקוז מתפרק לפירובט בציטופלזמה של התא באמצעות גליקוליזה, מסלול מטבולי, המייצר אנרגיה בצורה של אדנוזין טריפוספט, או ATP, לתהליכים מטבוליים תאיים.

כדי למדוד את ספיגת הגלוקוז ex vivo, התחל עם רקמת כבד עכבר בגודל קטן שנקטף טרי. יש להוסיף חוצץ מתאים לשמירה על תנאים פיזיולוגיים.

לאחר מכן, העבירו את הרקמה לצלחת מרובת בארות המכילה מדיה נטולת גלוקוז. עקוב אחריו על ידי דגירה במדיה נטולת גלוקוז בתוספת דאוקסיגלוקוז, אנלוגי גלוקוז עם תווית פלואורסצנטית. גודלה הקטן של הרקמה מאפשר כניסת דאוקסיגלוקוז.

דאוקסיגלוקוז נכנס לתאים דרך מובילי גלוקוז, בהיעדר גלוקוז. בתוך התאים, דאוקסיגלוקוז עובר זרחון אך אינו עובר חילוף חומרים נוסף, מה שמוביל להצטברו.

אסוף את המדיה המכילה דאוקסיגלוקוז עם תווית פלואורסצנטית לא מנוצלת בנקודות הזמן הרצויות. בעזרת קורא מיקרו-פלטות, מדוד את הקרינה של הדאוקסיגלוקוז החוץ-תאי, אשר יכול להיות מתואם עם ספיגת הרקמה התוך תאית של דאוקסיגלוקוז.

דגרו על הרקמות או האיברים שנקטפו בצלחת בת 6 בארות המכילה PBS למשך דקה אחת. טפל בכל רקמה או איבר בבאר נפרדת. לאחר דקה אחת, הניחו כל טישו על מגבת נייר סטרילית לספיגת PBS.

העבירו רקמות או איברים בצלחת נפרדת של 6 בארות המכילה 4,000 מיקרוליטר של DMEM נטול גלוקוז, ודגרו במשך שתי דקות. לאחר שתי דקות, הסר והעביר את הרקמות לבארות של צלחת בת 6 בארות המכילה תמיסת עבודה של 0.29 מילי-מולרית FD-גלוקוז. דגרו את צלחות 6 הבארות המכילות רקמות בתמיסת עבודה FD-גלוקוז ב-37 מעלות צלזיוס.

אסוף 100 מיקרוליטר של תמיסת עבודה FD-גלוקוז מכל באר לאחר 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 ו-120 דקות של דגירה, והעביר 100 מיקרוליטר של תמיסת עבודה FD-גלוקוז שנאספה לצלחות של 96 בארות כדי לנתח את הקינטיקה של דלדול גלוקוז FD-חוץ-תאי. יש לנער לפני ואחרי האיסוף.

מדוד את הקרינה באורכי גל עירור ופליטה של 485 ו-535 ננומטר בהתאמה באמצעות קורא מיקרו-פלטות.