אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 3:45 דק׳ • July 8th, 2025
בדופן אבי העורקים יש בעיקר תאי שריר חלק, או SMCs, המכילים מנגנון חלבון מתכווץ המתכווץ ונרגע כדי לווסת את זרימת הדם באבי העורקים.
כדי למדוד את תגובת ההתכווצות של SMCs אבי העורקים במבחנה, השג צלחת מרובת בארות המכילה מערך חיישנים של חישת עכבה של תא חשמלי, או ECIS. כל מערך מכיל אלקטרודות סרט זהב בתחתית הבאר, המתוחמות בסרט בידוד. מצפים את הבארות בג'לטין.
זרע תרחיף SMC אנושי ראשוני לבארות. העבר את לוחית הבאר המכילה ECIS למחזיק צלחת המחובר למגבר ומערכת רכישת נתונים תוך הקפדה על מגע אלקטרודה עם המחזיק. הפעל זרם חילופין קבוע קטן בין האלקטרודות כדי למדוד את הפוטנציאל עליהן.
במהלך הדגירה, SMCs נדבקים ומתפשטים על ציפוי הג'לטין. התאים מתנהגים כמבודדים, ומגבילים את זרימת הזרם בין האלקטרודות. ככל שיותר תאים מתחברים לפני השטח, זרימת הזרם פוחתת עוד יותר. כתוצאה מכך, העכבה, או ההתנגדות לזרימה הנוכחית, והפוטנציאל גדל. בסופו של דבר, התאים מתרבים על האלקטרודות ויוצרים שכבה אחת.
טפל ב-SMCs עם יונופור סידן כדי להקל על הובלת יוני סידן על פני קרומי התא. זרם יוני הסידן החוץ-תאי מפעיל את מנגנון ההתכווצות, וגורם להתכווצות.
SMCs מגורים מתכווצים ומאבדים מגע תא-תא על האלקטרודות. ההפחתה המתקבלת בכיסוי פני השטח של האלקטרודה מפחיתה את העכבה, ומאפשרת כימות בזמן אמת של התכווצות SMC.
ספרו את התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי, וזרעו את ה-SMCs בשלוש עותקים בצפיפות זריעה של 30,000 תאים לבאר, ב-200 מיקרוליטר של מדיום SMC בצלחת ECIS מצופה ג'לטין. הנח את הצלחת עם ה-SMCs לתוך מחזיק הבאר ECIS 96 בחממת תרבית התאים.
לחץ פעמיים על "תוכנת ECIS Applied Biophysics" כדי לפתוח את התוכנית, ולחץ על כפתור "הגדר". בדוק אם לכל האלקטרודות יש מגע עם המחזיק, בפאנל התחתון השמאלי שכותרתו "תצורת באר". אם האלקטרודות אינן מחוברות כהלכה, כוונן את הצלחת במחזיק לפני תחילת המדידה.
כעת, בחר את סוג הצלחת באותו לוח על ידי לחיצה על "סוג מערך". לאחר מכן, הכינו שתי פיפטות בנפח 2 מיקרוליטר ו -150 מיקרוליטר. לפני תחילת הגירוי, לחץ על "סמן" בתוכנה, והוסף תגובה.
כדי לעורר את התאים, הסר את המכסה והניח אותו על משטח סטרילי בתוך החממה. לאחר מכן, גרמו להתכווצות SMC על ידי החדרת 2 מיקרוליטר של תמיסת העבודה של היונומיצין לכל באר במהירות האפשרית.
לאחר גירוי כל התאים, ערבבו את המדיום בבארות באמצעות הפיפטה השנייה.