The Gliding Actin Filament Assay: An In Vitro Motility Assay to Study Translocation of Actin Filaments on Immobilized Myosins
אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 6:01 דק׳ • July 8th, 2025
מיוזין - חלבון מוטורי - מקיים אינטראקציה עם חלבון חוטי אחר, אקטין, וגורם לטרנסלוקציה שלו.
כדי לנתח את תנועת הגלישה של אקטין, הרכיבו תא זרימה מבוסס שקופיות זכוכית כך שהחלק הפנימי של החלק העליון של החדר מצופה ניטרוצלולוז. זורמים בחלבוני המיוזין דרך החדר, המשתקעים מעל ציפוי הניטרוצלולוזה.
השלם את החדר עם חוטי אקטין ללא תווית - אקטין שחור - והוסף מאגר תנועתיות המכיל מולקולות אדנוזין טריפוספט או ATP.
חוטי האקטין נקשרים למיוזינים פעילים משותקים יחד עם מיוזינים לא פעילים או מתים. מולקולות ATP מקיימות אינטראקציה עם המיוזינים הפעילים, מה שמוביל להתנתקות שלהם מאקטינים שחורים בעוד המיוזינים הלא פעילים נשארים קשורים לאקטין.
צנטריפוגה לגלולה מיוזינים לא פעילים המחוברים לאקטין שחור. שטפו היטב עם חוצץ כדי להסיר את גלולת המיוזין הלא פעילה, חוטי אקטין חופשיים ו-ATPs שאינם בשימוש. זרימה באקטין עם תווית פלואורסצנטית הקושרים מיוזינים פעילים משותקים.
השלם את החדר עם מאגר סופי המכיל חומר צפיפות - מתיל צלולוז ו- ATP. חומר הצפיפות מאלץ את חוטי האקטין להישאר קרובים יותר לפני השטח של החדר.
כל מיוזין פעיל מבצע הידרוליזה של ATP מה שמוביל לשינוי קונפורמציה ונקשר למיקום חדש לאורך הנימה, ויוצר מהלך כוח שמחליק את האקטין על מיוזין.
התבונן בתא תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לתעד את תנועת חוטי האקטין המסומנים המחליקי
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים