בדיקת תנועתיות הפוכה: טכניקה במבחנה לדמיין תנועת מיוזין על חוטי אקטין משותקים

למיוזין - חלבון מוטורי - יש תחום ראש כדורי המקיים אינטראקציה עם אקטין - חלבון נימי. אינטראקציה זו חיונית לטרנסלוקציה של מיוזין לאורך חוטי האקטין. כדי לחקור את הקישור הזה במבחנה, בצע בדיקת תנועתיות הפוכה של מיוזין על אקטין קשור על פני השטח.

כדי להתחיל, הרכיבו תא בדיקה על ידי הנחת כיסוי פוליאתילן גליקול ביוטיניל - מצופה PEG מעל שקופית מיקרוסקופ כך שהמשטח המצופה פונה כלפי פנים, ויוצר את החלק העליון של החדר.

העבירו תמיסה המכילה אבידין - גליקופרוטאין - דרך החדר. אבידין נקשר לביוטין עם זיקה גבוהה, מה שמשפר את הידבקות האקטין. לאחר מכן, זרימה בחוטי אקטין מתויגים ביוטין המסומנים בפלואורופור אדום. ליגנד הביוטין נקשר לאבידין, ומשתק את החוטים על משטח הכיסוי.

לבסוף, הוסף חלבוני מיוזין 5A פלואורסצנטיים ירוקים המסומנים בחלבון פלואורסצנטי במאגר המכיל מולקולות אדנוזין טריפוספט, או ATP. מיוזין דו-ראשי 5A, המכיל ראש נגרר ומוביל, מקיים אינטראקציה עם חוטי האקטין המשותקים. הראש הנגרר של המיוזין נקשר ל-ATP ומתנתק מאקטין.

ההידרוליזה של ה-ATP יוצרת מהלך כוח, המאפשר לראש הנגרר להיקשר למצב לפני הראש המוביל לאורך הנימה. באמצעות משיכות כוח עוקבות, המיוזין נע לאורך חוט האקטין המשותק מבלי להתנתק.

בעזרת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, רשום את התנועה של מולקולות המיוזין הירוקות על חוטי האקטין האדומים.

הכן את התמיסות לבדיקת תנועתיות הפוכה של מיוזין 5a, ושמור אותם על קרח.

שטפו את החדר עם 10 מיקרוליטר של מאגר תנועתיות עם DTT. זרימה ב-10 מיקרוליטר של 1 מיליגרם למיליליטר BSA במאגר תנועתיות עם DTT. חזור על כך פעמיים, המתן דקה לאחר הכביסה השלישית. השתמש בנייר טישו או נייר סינון כדי לנדף את התמיסה דרך התעלה על ידי הנחת פינת הנייר בעדינות ביציאה מתא הזרימה.

לאחר מכן, שטפו את החדר עם 10 מיקרוליטר של מאגר תנועתיות עם DTT שלוש פעמים. זרום ב-10 מיקרוליטר של תמיסת NeutrAvidin במאגר תנועתיות עם DTT, והמתן דקה אחת. לאחר מכן, שטפו עם 10 מיקרוליטר מהתמיסה הזו שלוש פעמים.

זרמו פנימה 10 מיקרוליטר של מאגר תנועתיות המכיל bRh-actin עם DTT באמצעות קצה פיפטה משועמם גדול, והמתינו דקה אחת. לאחר מכן, שטפו עם 10 מיקרוליטר של מאגר תנועתיות עם DTT שלוש פעמים.

זרימה ב-30 מיקרוליטר של מאגר סופי עם 10 מיוזין ננו-מולרי 5a, וטענה מיד על מיקרוסקופ הקרינה של ההשתקפות הפנימית הכוללת. התחל להקליט לאחר שנמצא המיקוד האופטימלי להדמיית TIRF.