בדיקת כדאיות לוציפראז מבוססת ATP: שיטה הומוגנית להערכת הפוטנציאל מעכב הצמיחה של סוכני בדיקה על אורגנואידים סרטניים

אדנוזין טריפוספט, ATP, מקור האנרגיה העיקרי של התא, חיוני לתפקודים תאיים מגוונים. תחת לחץ, רמות ה-ATP התוך-תאיות מושפעות לרעה, מה שהופך את ה-ATP לסמן טוב לתאים פעילים מטבולית וברי-קיימא.

כדי להתחיל, תרחיף תאי גידול זרעים למיקרו-צלחת בעלת דופן שחורה ותחתית שקופה לפיזור אור מינימלי במהלך מדידת עוצמת האור. המיקרו-צלחת מורכבת מציפוי הידרוג'ל המונע מהתאים להיצמד לצלחת, ומאפשר אינטראקציה בין תאים והרכבה עצמית לאורגנואידים של הגידול - תרביות רקמה תלת מימדיות המחקות מיקרו-סביבה של גידול.

לאחר מכן, טפל בתרכובת בדיקה. תרכובת הבדיקה מקיימת אינטראקציה עם תאי האורגנואידים, ובהתאם לפוטנציאל מעכב הגדילה שלה, עלולה לשבש את התהליכים המטבוליים המייצרים אנרגיה, וכתוצאה מכך לדלדול ATP תוך תאי.

לאחר הטיפול, הוסף מגיב שלב אחד הכולל חומרי ניקוי, מעכבי ATPase, האנזים לוציפראז, סובסטרט ספציפי ללוציפראז, לוציפרין ויוני מגנזיום. דגירה למשך הזמן הרצוי.

חומר הניקוי ממיס את ממברנות התאים, וגורם לליזה של תאים ומיצוי ATP לתמיסה, בעוד שמעכבי ה-ATPase משביתים את כל ה-ATPases האנדוגניים המשתחררים, ומייצבים את ה-ATP.

לאחר מיצוי, ATP, בנוכחות יוני מגנזיום, מקל על לוציפרין להיקשר ללוציפראז, המחמצן לוציפרין לאוקסילוציפרין בעל אנרגיה גבוהה שלאחר הרפיה, מייצר פוטון ביולומינסנצינטי.

בעזרת לומינומטר מודדים את עוצמת האור המופקת על ידי הפוטונים, המייצגים את ריכוז ה- ATP התוך-תאי. כמויות נמוכות יותר של ATP מצביעות על כדאיות נמוכה יותר של התאים, מה שמרמז על פוטנציאל מעכב גדילה גבוה יותר של תרכובת הבדיקה.

לאחר 24 שעות של שינוי בינוני, טחנו את האורגנואידים של הגידול באמצעות מכשיר פיצול ופיזור תאים, המצויד במחזיק מסנן המכיל מסנן רשת של 70 מיקרומטר. לדלל 15 מילימטרים של תרחיף אורגנואיד גידול 10 פעמים.

השתמש במתקן תרחיף התאים כדי לזרוע 40 מיקרוליטר של תרחיף אורגנואיד גידול מדולל במיקרו-פלטה ספרואידית נמוכה במיוחד של 384 בארות.

לאחר 24 שעות, השתמש במטפל בנוזלים כדי להוסיף 0.04 מיקרוליטר של תמיסות חומר בדיקה מ-10 דילולים סדרתיים בטווחי ריכוז סופיים של 20 מיקרומולר עד 1.0 ננו-מולר בבארות, ודגירה על הצלחת למשך 6 ימים.

בתום הדגירה מוסיפים מגיב למדידת ATP תוך תאי בבארות הבדיקה. השתמש במיקסר כדי לערבב את תכולת הצלחת ולדגור את הצלחת למשך 10 דקות בחום של כ -25 מעלות צלזיוס. השתמש בקורא לוחות כדי למדוד את תכולת ה- ATP התוך-תאי כזוהר.