בדיקת הדמיה פלואורסצנטית: טכניקה להמחשת עקה חמצונית בתאי אורגנואיד בתרבית של מיני חמצן תגובתי שטופלו על ידי השראת תאים אורגנואידים במעי

אורגנואידים במעי מסכמים את ארגון הקריפטו-וילוס דמוי המעיים בעל לומן מרכזי המורכב מתאים מתים ופסולת. הלומן מרופד בתאים דמויי וילוס ובליטות דמויות קריפטה ניצנים המכילים תאי גזע.

תאים אורגנואידים שונים מייצרים רמות שונות של מיני חמצן תגובתיים, ROS - תוצרי לוואי של פעילויות מטבוליות, שהצטברותם מובילה למתח חמצוני.

כדי לדמיין מתח חמצוני בתאים מגוונים, התחל בלקיחת צלחת מרובת בארות המכילה אורגנואידים תלת מימדיים מתורבתים במטריצת מרתף. תאי הגזע האורגנואידים מבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק או חלבון מתויג GFP המסייע להבחין ביניהם במהלך ההדמיה.

השלימו את הבארות עם טרט-בוטיל הידרופרוקסיד - משרה ROS - ודגרו. המשרה מפעיל את NADPH אוקסידאז הקשור לממברנה וממריץ את ייצור ה-ROS בתוך התאים. תאי גזע, בהיותם פעילים מטבולית, מייצרים יותר ROS מאשר תאים מובחנים.

הוסף בדיקות פלואורוגניות רגישות ל-ROS. בדיקות ליפופיליות אלה נכנסות במהירות לתאים ומגיבות עם ROS כדי לייצר פלואורסצנטיות אדומה. טפל באורגנואידים בצבע Hoechst שמכתים באופן סלקטיבי גרעיני תאים חיים. דמיין את האורגנואידים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.

תאים אורגנואידים בפריפריה עם גרעינים מוכתמים מראים דרגות שונות של פלואורסצנטיות אדומה, שהיא גבוהה בתאי הגזע המבטאים GFP ונמוכה בתאים הממויינים. התאים המתים עם רמות ROS גבוהות מטבעם מציגים פלואורסצנטיות אדומה