בדיקת ציטומטריית זרימה לכימות עקה חמצונית: בדיקה לכימות מיני חמצן תגובתי באורגנואידים במעיים באמצעות בדיקות פלואורוגניות

תאי מעיים מייצרים מיני חמצן תגובתיים - ROS. רמות ROS מתונות שומרות על הומאוסטזיס תאי, בעוד שרמות ROS גבוהות עלולות לגרום למוות של תאים.

כדי לכמת את רמות ה-ROS במבחנה, התחל בתרבית של אורגנואידים תלת מימדיים במעי העכבר. אורגנואידים אלה מציגים ארכיטקטורת מעיים-אפיתל עם בליטות דמויות קריפטה המכילות תאי גזע ירוקים המבטאים פלואורסצנטיות. הם מכילים גם תאים מובחנים דמויי וילוס בפריפריה, המקיפים את הלומן המרכזי המורכב מתאים מתים ופסולת. כל התאים האלה מייצרים רמות שונות של ROS.

כעת, טפל באורגנואידים בבארות המיועדות באמצעות מאפנני ROS. בהתבסס על אופיים, מודולטורים יכולים לפעול כמשרים או מעכבי ROS. לאחר הדגירה למשך הזמן הנדרש, הסר את המדיום המושקע.

הוסף אנזים פרוטאוליטי לתרבית, משבש את הארכיטקטורה התלת מימדית של האורגנואידים ומשחרר תאים שונים בתרחיף. לאחר מכן, הוסף בדיקה פלואורוגנית רגישה ל-ROS ודגירה.

עם כניסתם לתאים, הגשושיות מגיבות עם ROS ומתחמצנות כדי לייצר פלואורסצנטיות אדומה. טפלו בתאים ב-DAPI - צבע פלואורסצנטי קושר DNA - שצובע באופן סלקטיבי את גרעיני התאים המתים - ויוצר ניגוד עם התאים החיים.

בעזרת ציטומטר זרימה, נתח את התאים החיים השליליים ל- DAPI כדי לקבל אות פלואורסצנטי אדום המתאים לרמת ה- ROS שלהם. בהתאם לאופי המודולטורים, המשרתים מעלים את רמות ה-ROS בעוד המעכבים מפחיתים אותן.

הוסף 1 מיקרוליטר של תמיסת מלאי N-אצטיל ציסטאין בבארות הבקרה השליליות של הצלחת התחתונה העגולה בת 96 הבארות המכילה את האורגנואידים.

לאחר דגירה של שעה, הוסיפו תמיסת מלאי טרט-בוטיל הידרופרוקסיד 1 מיקרוליטר בבארות המתאימות, ודגרו למשך 30 דקות. לאחר מכן, בעזרת פיפטה רב-ערוצית, הסר את המדיום מבלי להפריע ל- BMM המצורף, והעביר אותו לצלחת תחתונה עגולה נוספת של 96 בארות. שמור את הצלחת הזו בצד.

לאחר מכן, הוסיפו 100 מיקרוליטר של טריפסין, ובעזרת פיפטה רב-ערוצית, פיפטה למעלה ולמטה חמש פעמים כדי להרוס את ה-BMM. לאחר דגירה קצרה של 5 דקות, נתקו את האורגנואידים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה בפעם השנייה.

סובבו את הצלחת, והשליכו את הסופרנטנט על ידי היפוך הצלחת. הוסף את המדיום שנאסף בעבר בצלחת נוספת של 96 בארות, בחזרה לבארות המתאימות, והשהה מחדש את התאים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה חמש פעמים.

לאחר מכן, הוסף 1 מיקרוליטר מהגשושית הפלואורוגנית, ודגר למשך 30 דקות. לאחר מכן, סובב שוב את הצלחת והשהה מחדש את התאים עם 250 מיקרוליטר של תמיסת DAPI. העבירו את הדגימות בצינורות ציטומטריית זרימה, ושמרו את הצינורות על קרח.

מטב את הגדרות מתח הפיזור קדימה והצד על מתחי בקרה ולייזר לא מוכתמים, עבור כל פלואורופור באמצעות דגימות מוכתמות מונו. לאחר מכן, באמצעות אסטרטגיית שער מתאימה, אסוף מינימום של 20,000 אירועים.