אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 6:00 דק׳ • July 8th, 2025
SUMOylation מתרחשת עקב הצמדה של משנים קטנים דמויי יוביקוויטין, SUMOs, לחלבוני סובסטרט.
SUMOylation מתרחשת כאשר פפטיד SUMO בוגר מופעל על ידי אנזים - E1. עם ההפעלה, ה-SUMO מועבר לאתר הפעיל של האנזים המצומד - E2 - ומחבר את ה-SUMO לשאריות הליזין של חלבון הסובסטרט. ליגאז נוסף - E3 - משפר את יעילות האינטראקציה הזו.
כדי לבצע בדיקת SUMOylation במבחנה, התחל עם צינור המכיל תערובת של חלבון הסובסטרט - p53, אנזימים ופפטידים של SUMO, ודגר כדי לגרום ל-SUMOylation. השלם את הצינור עם נתרן דודציל סולפט - מאגר המכיל SDS, ומפסיק את התגובה. מחממים את הדגימה כדי לנטרל את החלבונים.
טען את תערובת החלבון לבאר של ג'ל SDS-PAGE ובצע אלקטרופורזה. משקל מולקולרי גבוה יותר חלבונים SUMOylated נעים לאט יותר מהגרסאות הלא-SUMOylated שלהם, ויוצרים שתי רצועות נפרדות.
העבירו את הג'ל על קרום סופג הקיים על נייר סינון רטוב במנגנון אלקטרו-בלוטינג. מכסים בנייר פילטר רטוב ומעבירים את החלבונים מהג'ל אל הממברנה.
טפל בקרום עם נוגדנים נגד p53, הנקשרים ל-p53. שכבה עם נוגדנים משניים מצומדים לאנזים הנקשרים לקומפלקסים של נוגדנים-p53. הוסף מצע כימילומינסנט ליצירת מוצר זוהר והדמיה של הממברנה.
פס משקל מולקולרי גבוה יותר מתאים לחלבונים SUMOylated, בעוד שהרצועה התחתונה תואמת לגרסאות חלבון שאינן SUMOylated.
הוסף 3 מיקרוליטר של 100 ננוגרם ל
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים