בדיקת SUMOylation: טכניקה במבחנה לזיהוי מצב SUMOylation של חלבוני סובסטרט על ידי immunoblotting

SUMOylation מתרחשת עקב הצמדה של משנים קטנים דמויי יוביקוויטין, SUMOs, לחלבוני סובסטרט.

SUMOylation מתרחשת כאשר פפטיד SUMO בוגר מופעל על ידי אנזים - E1. עם ההפעלה, ה-SUMO מועבר לאתר הפעיל של האנזים המצומד - E2 - ומחבר את ה-SUMO לשאריות הליזין של חלבון הסובסטרט. ליגאז נוסף - E3 - משפר את יעילות האינטראקציה הזו.

כדי לבצע בדיקת SUMOylation במבחנה, התחל עם צינור המכיל תערובת של חלבון הסובסטרט - p53, אנזימים ופפטידים של SUMO, ודגר כדי לגרום ל-SUMOylation. השלם את הצינור עם נתרן דודציל סולפט - מאגר המכיל SDS, ומפסיק את התגובה. מחממים את הדגימה כדי לנטרל את החלבונים.

טען את תערובת החלבון לבאר של ג'ל SDS-PAGE ובצע אלקטרופורזה. משקל מולקולרי גבוה יותר חלבונים SUMOylated נעים לאט יותר מהגרסאות הלא-SUMOylated שלהם, ויוצרים שתי רצועות נפרדות.

העבירו את הג'ל על קרום סופג הקיים על נייר סינון רטוב במנגנון אלקטרו-בלוטינג. מכסים בנייר פילטר רטוב ומעבירים את החלבונים מהג'ל אל הממברנה.

טפל בקרום עם נוגדנים נגד p53, הנקשרים ל-p53. שכבה עם נוגדנים משניים מצומדים לאנזים הנקשרים לקומפלקסים של נוגדנים-p53. הוסף מצע כימילומינסנט ליצירת מוצר זוהר והדמיה של הממברנה.

פס משקל מולקולרי גבוה יותר מתאים לחלבונים SUMOylated, בעוד שהרצועה התחתונה תואמת לגרסאות חלבון שאינן SUMOylated.

הוסף 3 מיקרוליטר של 100 ננוגרם למיקרוליטר של תג מטוהר K-bZIP בתגובת תערובת מאסטר SUMOylation במבחנה. לאחר מכן, מערבבים בעדינות את תכולת תערובת המאסטר, ודוגרים בחום של 30 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות.

לאחר מכן, הוסף 20 מיקרוליטר של 2x SDS-PAGE עם מאגר טעינה כדי לעצור את התגובה. לאחר מכן, מחממים את הדגימות ב-95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי לנטרל את החלבון.

לאחר מכן, טען 20 מיקרוליטר מהדגימה על ג'ל SDS-PAGE של 10%, והפעל את הג'ל ב-80 וולט למשך כ-120 דקות עד שהצבע מגיע לתחתית הג'ל.

לאחר סיום האלקטרופורזה, נתק את מנגנון הג'ל והעביר את הג'ל במאגר העברה חצי יבש למשך 5 דקות. לאחר מכן, יש להשרות את קרום ה- PVDF במיכל אחר מלא במתנול למשך דקה.

הסר את קרום ה-PVDF מהמתנול, והשרו במאגר העברה חצי יבש. לאחר מכן, מערבבים בעדינות את הממברנה למשך 5 דקות.

הסר את מכסה הבטיחות של המנגנון האלקטרופורטי היבש למחצה. הרטיבו מראש נייר פילטר, והכינו כריך ג'ל בתחתית אנודת הפלטינה. לאחר אבטחת לוחית הקתודה במכסה הבטיחות, הפעל את הכתם בזרם קבוע של 15 וולט למשך 90 דקות. לאחר מכן, כבה את אספקת החשמל והוציא את קרום ה- PVDF החוצה, לאחר ניתוק המנגנון היבש למחצה.

כעת, חסום את קרום ה- PVDF עם מאגר חוסם, למשך שעה בטמפרטורת החדר על שייקר מסלולי ב -30 סיבובים לדקה. לאחר מכן, הכלאה של קרום ה-PVDF עם נוגדן נגד p53 וחוצץ חוסם למשך 12 עד 16 שעות ב-4 מעלות צלזיוס, על מערבל מתלה ב-30 סיבובים לדקה.

לאחר מכן, הוציאו את קרום ה-PVDF, והעבירו במיכל מלא במי מלח עם חוצץ TRIS עם Tween-20. לאחר מכן, יש להשרות את קרום ה-PVDF במי מלח עם חוצץ TRIS עם Tween-20 למשך 30 דקות על שייקר המסלול ב-45 סיבובים לדקה. לאחר מכן, הכלאה של קרום ה-PVDF עם נוגדן נגד ארנב מצומד עם חזרת פרוקסידאז מדולל במאגר חוסם, למשך שעה בטמפרטורת החדר על מערבל ההשעיה ב-30 סיבובים לדקה.

לאחר מכן, שטפו את קרום ה-PVDF עם מי מלח עם חוצץ TRIS עם Tween-20 שלוש פעמים. לאחר הכביסה, יש להשרות את קרום ה-PVDF בתמיסת מלח Tween-20 עם חוצץ TRIS למשך 30 דקות על מערבל ההשעיה ב-45 סיבובים לדקה. לאחר מכן, החלף את תמיסת המלח Tween-20 עם חוצץ TRIS בתמיסת מלח עם חוצץ פוספט כדי לשמר את קרום ה-PVDF ב-4 מעלות צלזיוס עד 12 שעות.

לאחר מכן, ערבבו את ריאגנטים למצע כימילומינסנט משופר 1 ו-2 ביחס של 1:1. לאחר מכן, הסר את קרום ה-PVDF ממי המלח המאוחסנים בפוספט, וכתם לזמן קצר עם כיסי אגרוף כדי לספוג את עודף הלחות.

מיד, הוסף 400 מיקרוליטר של המגיב הכימילומינסנט למשטח הממברנה, והמתן 3 עד 5 דקות. כתם בקצרה כדי לנקז את המגיב הכימילומינסנט העודף, ומונע מהקרום להתייבש לחלוטין. השתמש במערכת הדמיית זוהר כדי לחשוף את הכתם.