אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 2:59 דק׳ • July 8th, 2025
חלבונים גרעיניים מקופלים בצורה לא נכונה חסרי מבנה שלישוני מוגדר מתויגים עם משנים קטנים דמויי יוביקוויטין, SUMOs ומולקולות יוביקוויטין, המאפשרים את פירוקם על ידי המערכת הפרוטאוליטית, כולל מערכת היוביקוויטין-פרוטאזום, ה-UPS.
במספר מחלות נוירודגנרטיביות, תפקוד לקוי של UPS גורם להצטברות והצטברות של חלבונים לא מקופלים גרעיניים, מה שמוביל למוות עצבי.
כדי לחקור את קצב הפירוק של חלבונים מקופלים בצורה לא נכונה גרעינית במבחנה, טפל בתרבית של תאי יונקים דבקים בתערובת הכוללת DNA פלסמיד מקודד חלבון מקופל פלואורסצנטי ומגיב טרנספקציה.
תאים שעברו טרנספטציה מוצלחת מבטאים חלבונים קצרים בעלי תווית פלואורסצנטית, בעלי זמן מחצית חיים שגוי המתויגים באות לוקליזציה גרעינית. עם הובלה לגרעין, חלבונים לא מקופלים אלה עוברים SUMOylation ו-ubiquitination ומועברים ל-UPS לצורך פירוק ופינוי חלבונים.
לאחר הדגירה, החלף את המדיום במדיום פלואורסצנטי נמוך המכיל ציקלוהקסימיד. ציקלוהקסימיד, מולקולה חדירה לתאים, נקשרת ליחידה הריבוזומלית הגדולה וחוסמת את שלב ההתארכות של תרגום החלבון וסינתזת חלבון נוספת, מה שמקל על חקר קצב הפירוק של החלבונים המתורגמים המקופלים בצורה לא נכונה המסומנים בפלואורסצנט.
טפל בקבוצה של בארות עם מעכב פרוטאזום כדי לחסום את פעילות הפרוטאזום ולגרום להצטברות חלבונים לא מקופלים. בעזרת קורא מיקרו-פלטות, מדוד
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים