JoVE Encyclopedia of Experiments
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 2:59 דק' • July 8th, 2025
חלבונים גרעיניים מקופלים בצורה לא נכונה חסרי מבנה שלישוני מוגדר מתויגים עם משנים קטנים דמויי יוביקוויטין, SUMOs ומולקולות יוביקוויטין, המאפשרים את פירוקם על ידי המערכת הפרוטאוליטית, כולל מערכת היוביקוויטין-פרוטאזום, ה-UPS.
במספר מחלות נוירודגנרטיביות, תפקוד לקוי של UPS גורם להצטברות והצטברות של חלבונים לא מקופלים גרעיניים, מה שמוביל למוות עצבי.
כדי לחקור את קצב הפירוק של חלבונים מקופלים בצורה לא נכונה גרעינית במבחנה, טפל בתרבית של תאי יונקים דבקים בתערובת הכוללת DNA פלסמיד מקודד חלבון מקופל פלואורסצנטי ומגיב טרנספקציה.
תאים שעברו טרנספטציה מוצלחת מבטאים חלבונים קצרים בעלי תווית פלואורסצנטית, בעלי זמן מחצית חיים שגוי המתויגים באות לוקליזציה גרעינית. עם הובלה לגרעין, חלבונים לא מקופלים אלה עוברים SUMOylation ו-ubiquitination ומועברים ל-UPS לצורך פירוק ופינוי חלבונים.
לאחר הדגירה, החלף את המדיום במדיום פלואורסצנטי נמוך המכיל ציקלוהקסימיד. ציקלוהקסימיד, מולקולה חדירה לתאים, נקשרת ליחידה הריבוזומלית הגדולה וחוסמת את שלב ההתארכות של תרגום החלבון וסינתזת חלבון נוספת, מה שמקל על חקר קצב הפירוק של החלבונים המתורגמים המקופלים בצורה לא נכונה המסומנים בפלואורסצנט.
טפל בקבוצה של בארות עם מעכב פרוטאזום כדי לחסום את פעילות הפרוטאזום ולגרום להצטברות חלבונים לא מקופלים. בעזרת קורא מיקרו-פלטות, מדוד את הקרינה של החלבונים המקופלים בצורה שגויה.
ירידה תלוית זמן בקרינה מעידה על פירוק חלבון לא מקופל. תאים שטופלו במעכב הפרוטאזום מציגים עוצמת פלואורסצנטיות דומה לאורך זמן, מה שמצביע על עיכוב של פירוק חלבון לא מקופל
.לאחר זריעה וטרנספקציה של תאי HeLa בצלחות של 96 בארות על פי פרוטוקול הטקסט; 20 עד 24 שעות לאחר הטרנספקציה, בדוק את התאים לביטוי GFP. הסר את המדיום בכ-200 מיקרוליטר של 1x PBS לכל באר, ולאחר מכן, שאב אותו כדי להסיר את שאריות ה-DMEM.
הוסף 60 מיקרוליטר של DMEM פלואורסצנטי נמוך עם 5% FBS, ו-50 מיקרוגרם למיליליטר של ציקלוהקסימיד, והוסף 10 מיקרו-מולרי MG132 לקבוצה אחת של דגימות.
בעזרת קורא צלחות פלואורסצנטי, מדוד את אות ה-GFP הקורא את הלוחות כל שעה עד 8 עד 10 שעות. ייצא את הנתונים, ובצע ניתוח סטטיסטי על פי פרוטוקול הטקסט.