JoVE Encyclopedia of Experiments
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 2:36 דק' • July 8th, 2025
לוציפראז הוא אנזים המחמצן את המצע שלו ליצירת תוצר ביולומינסנצינטי.
תכונה זו של לוציפראז מועילה לתכנון מערכת דיווח מבוססת ננו-לוציפראז שבה נעשה שימוש בגרסה המפוצלת של האנזים. במערכת זו, השברים הקטנים והגדולים יותר הם בעלי זיקה גבוהה זה לזה ויכולים להרכיב מחדש את האנזים הפונקציונלי.
כדי להשתמש במערכת המבוססת על ננו-לוציפראז לזיהוי חלבון המטרה - תחום קשירת הקולטן של גליקופרוטאין ספייק SARS-CoV-2 - התחל בצלחת תרבית המכילה תאים דבקים. תאים אלה מכילים פלסמיד המקודד את חלבון המטרה בשילוב עם רצף ספציפי לשבר הקטן יותר של ננו-לוציפראז מהונדס.
עם הביטוי, התאים המתורבתים מייצרים ביו-ריפורטרים - חלבוני מטרה רקומביננטיים המאוחים עם המקטע הקטן יותר של לוציפראז. טפל בתאים עם מאגר ליזה, ודגירה תחת תסיסה. רכיבי המאגר מפרקים במהירות את התאים - ומשחררים את התוכן התאי, כולל הביו-ריפורטרים, לתוך הסופרנטנט.
העבירו את הסופרנטנט לצלחת בדיקה מרובת בארות. השלימו כל באר בתמיסה המכילה את השברים הגדולים של ננו-לוציפראז מפוצל, ודגרו.
במהלך הדגירה, השבר הגדול נקשר באופן ספונטני ליחידת המשנה הקטנה של הביו-מדווח ומשיג קונפורמציה פונקציונלית. הוסף תמיסה המכילה פורימזין - המצע, והניח את לוחית הבדיקה בלומינומטר.
האנזים הפונקציונלי מחמצן פורימזין, ופולט אות זוהר בהיר. גודל האות נמצא בקורלציה עם ריכוז חלבון המטרה.
כדי להעריך את האות הזוהר מהביו-ריפורטר באמצעות בדיקת לוציפראז, ראשית, הכינו את מרכיבי התגובה, והשתמשו בסופרנטנט כמקור של הביו-ריפורט.
יש לדלל את ה-LgBiT והמצע ל-1x לפני השימוש. העבירו 50 מיקרוליטר של הסופרנטנט מכל באר או צינור, לצלחת של 96 בארות, והוסיפו 50 מיקרוליטר של 1x LgBiT לכל באר. דגירה למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
פתח את תוכנת הלומינומטר. הוסף 50 מיקרוליטר של מצע 1x לכל באר. הנח את הצלחת בלומינומטר והפעל את התוכנה.