בדיקת נוגדנים מנטרלים AAV מבוססת תאים: טכניקה קולורימטרית לזיהוי נוגדנים מנטרלים נגד וירוסים ספציפיים הקשורים באדנו בסרום
אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 4:54 דק׳ • July 8th, 2025
נגיפים רקומביננטיים הקשורים לאדנו, rAAVs, נגיפי DNA מהונדסים גנטית, לא עטופים, חד-גדיליים, הם נשאי גנים טיפוליים מבטיחים.
rAAVs מתחברים לקולטני קרום תא המטרה ועוברים אנדוציטוזיס בתיווך קלתרין, מה שמקל על העברה גרעינית של גנום ה-rAAV וביטוי גנים טיפולי. עם זאת, נוגדנים מנטרלים של מערכת החיסון המכוונים נגד rAAVs נקשרים לאפיטופ הספציפי של rAAV, ומפריעים לקשירת קרום התא, כניסת התאים והעברת הגנים.
כדי לזהות נוגדנים מנטרלים כנגד rAAVs ספציפיים בסרום כבשים, ראשית, השג ריכוזים מתאימים של סרום מדולל. הוסף AAVs רקומביננטיים המבטאים את הגן פוספטאז אלקליין שליה אנושית, hPLAP, גן. אפשר לנוגדנים מנטרלים להיקשר ולנטרל AAVs.
העבירו תערובת זו לבארות של צלחת מרובת בארות המכילה תרבית תאי אפיתל אנושית דביקה. עם הדגירה, AAVs עוברים אנדוציטוזיס תאי. תאים מותמרים מבטאים hPLAP הקשור לקרום התא. עם זאת, AAVs מנוטרלים אינם יכולים להיכנס לתאים.
השליכו את המדיום מהבארות. השתמש בפרפורמלדהיד כדי לתקן את התאים. הוסף חיץ מחומם מראש, וחמם את התאים כדי לנטרל את הפוספטאז האלקליין התאי האנדוגני; hPLAP עמיד בפני השבתת חום.
הוסף את מצעי hPLAP - ברומוכלוריאנדוליל פוספט, BCIP וניטרו כחול טטרזוליום, NBT. hPLAP dephosphorylates BCIP, שעובר דימריזציה ויוצר ביניים כחול. יוני המימן המשתחררים מפחיתים את ה-NBT, ומייצרים משקע סגו
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים