JoVE Encyclopedia of Experiments
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 3:03 דק' • July 8th, 2025
הומאוסטזיס של חלבון תאי, או פרוטאוסטזיס, כרוך בוויסות קיפול ותפקוד החלבון, יחד עם פירוק של חלבונים לא מקופלים. במהלך ההזדקנות, מנגנון הפרוטאוסטזיס פוחת, מה שגורם לחלבונים לא מקופלים להצטבר ולהצטבר עוד יותר, וכתוצאה מכך לתפקוד לקוי של התאים.
כדי לקבוע ירידה בפרוטאוסטזיס הקשורה לגיל, התחל עם Caenorhabditis elegans טרנסגני למבוגרים מסונכרנים התפתחותית.
תאי השריר של תולעים אלה מבטאים חלבונים עם פוליגלוטמין מורחב באופן חריג, או polyQ, חוזר, מאוחים עם תג פלואורסצנטי. חלבוני PolyQ נוטים להתקפל בצורה שגויה, ולכן עם הצטברותם, יכולים ליצור אגרגטים.
העבירו את התולעים לשקופית מיקרוסקופ הכוללת כרית אגרוז ושיתקו עם כימיקל מתאים להדמיית תאים חיים. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, דמיין את שרירי דופן הגוף של התולעים לאורך תקופה כדי לקבוע את אותות המוקדים הפלואורסצנטיים הבהירים והפלואורסצנטיים, המתאימים לאגרגטים הפלואורסצנטיים של polyQ.
תוך ימים, עקב ירידה בפרוטאוסטזיס הקשורה לגיל, מתרחשת הצטברות מצטברת פוליQ מתקדמת, מה שמוביל למספר גבוה יותר של מוקדים פלואורסצנטיים. אגרגטים מוגברים של polyQ בתאי השריר גורמים לרעילות ולשיבוש תפקוד תאי השריר, וכתוצאה מכך לשיתוק.
תחת מיקרוסקופ, רשום את מספר התולעים החיות והמשותקות חסרות תנועה על גירויים מכניים. שיעור שיתוק תולעים מוגבר מצביע על ירידה בפרוטאוסטזיס הקשורה לגיל ברקמת השריר בתולעים.
כדי למדוד ירידה בפרוטאאוסטזיס ברקמת השריר, בחרו 20 בעלי חיים, והרכיבו אותם על שקופית מיקרוסקופ עם כרית אגרוז 3% וטיפה של 5 מיקרוליטר של נתרן אזיד 10 מילי-מולרי.
לאחר שכל התולעים משותקות, צלמו את כל גופם של בעלי החיים באמצעות עדשת הגדלה פי 10. השתמש במסנן FITC או YFP, ובאותה חשיפה, עבור כל בעל חיים. בסיום, השלך את השקופיות.
ספרו את מספר המוקדים בשרירי דופן הגוף של החיה כולה. מוקדים הם אותות בהירים ומנוקדים יותר שניתן להבדיל מהאות המסיס העמום יותר ברקע.
בימי ניקוד, הסתכלו על הצלחות עם החיות, ורשמו את מספר החיות המשותקות. לאחר מכן, הסר בעלי חיים משותקים מהצלחת.
בסיום הניסוי, חשב את שיעור השיתוק עבור כל מצב, ושרטט את התקדמות השיתוק.