בדיקה הומוגנית של קרבה זוהרת מוגברת: בדיקת קרבה מבוססת חרוזים לסינון מולקולות קטנות המעכבות אינטראקציות חלבון-חלבון

במערכות ביולוגיות, קרבתו של חלבון לבן זוגו הספציפי היא גורם מכריע לאינטראקציה מוצלחת בין חלבון לחלבון. עם מולקולות מעכבות קטנות, חלבונים אלה אינם יכולים להתקרב זה לזה, מה שמשבש את האינטראקציות ביניהם.

כדי לסנן מולקולות מעכבות לשיבוש אינטראקציות בין שני חלבונים - צ'פרון ומלווה משותף - קח צלחת מרובת בארות המכילה מולקולות קטנות שונות. השלימו את הבארות עם חרוזי תורם עם מלווים משותפים המחוברים למשטחיהם. חרוזים אלה מכילים רגישים לאור לבדיקת כימילומינסנציה.

הוסף תרחיץ של חרוזי מקבל מצומדים לרצפי הפפטידים שמקורם במלווה הנקשרים במיוחד למלווה. החרוזים מכילים צבע על בסיס תיוקסן ופלואורופורים החיוניים להדמיה.

בבארות עם מולקולות שאינן מעכבות, זיקות גבוהות בין הפפטידים הקשורים לצ'פרון לבין המלווים מושכים את החרוזים המקבלים והתורמים. בעוד שהחרוזים נשארים רחוקים כאשר קיימים מעכבים.

בעזרת קורא כימילומינסנציה, למד את האינטראקציה. עם הארה באורך גל מסוים, רגישי האור של חרוזי התורם פולטים חמצן יחיד בעל תגובה גבוהה.

ללא מולקולות מעכבות, המינים הנפלטים מגיעים קרוב לחרוזי קבלה הממוקמים קרוב ומגיבים עם מולקולות צבע, וגורמים לכימילומינסנציה. אנרגיה זו מפעילה את הפלואורופורים של החרוזים המקבלים, וגורמת לפליטת אור.

לעומת זאת, בבארות עם מולקולות מעכבות, חמצנים בודדים עוברים דעיכה, מה שמוביל להיעדר פליטת אור, מה שמעיד על עיכוב מוצלח של אינטראקציות חלבון-חלבון.

הוסף חרוזי תורם גלוטתיון בריכוז של 10 מיקרוגרם למיליליטר ב-PBS. הוסיפו את GST-FKBP51 לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם למיליליטר, ודגרו על התגובה למשך 10 דקות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס בחושך.

בצע דילולים סדרתיים של תרכובת הבדיקה ב-DMSO. הוסף 0.25 מיקרוליטר של דילול תרכובת בדיקה בשלוש עותקים, בפינת כל באר של צלחת בת 384 בארות.

לבקרה שלילית, הוסף 0.25 מיקרוליטר של DMSO, ולשליטה חיובית, הוסף 0.25 מיקרוליטר של פפטיד Hsp90 C-terminal בבארות.

הוסף 22.5 מיקרוליטר מהתמיסה המכילה חרוזי תורם גלוטתיון עם חלבונים מתויגים GST לכל באר. מנערים היטב את הצלחת בידיים ודוגרים בחושך בחום של 25 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.

לדלל את חרוזי המקבל עם הפפטיד המסוף Hsp90 C המצורף לריכוז של 100 מיקרוגרם למיליליטר ב-0.5x PBS. הוסף 2.25 מיקרוליטר חרוזי קבלה מדוללים לכל באר. יש לנער ולדגור את הצלחת בחושך למשך 15 דקות כפי שהודגם.

הפעל את מכשיר קורא הלוחות, מדוד את האות של הצלחת ונתח את הנתונים כמתואר בכתב היד הטקסט.