בדיקת פלאק וירוס: טכניקה למדידת וירוס הרפס סימפלקס זיהומי באמצעות כימות של רבדים שנוצרו בשכבה אחת של תאים נגועים בנגיף

כדי להתחיל, הכינו דילולים סדרתיים של נגיף הרפס סימפלקס, נגיף זיהומי עטוף, במאגר.

השג צלחת מרובת בארות המכילה שכבה אחת של תרבית תאי אפיתל רגישה לנגיף. החלף נפח ספציפי של מדיה במתלים ויראליים מדוללים, כדי להבטיח כיסוי חד-שכבתי אחיד. אפשר לנגיף לספוג על פני התא.

הסר את כל הווירוסים שאינם נספגים. מכסים את שכבת התא במדיה המכילה מתיל צלולוז, ויוצרים כיסוי חצי מוצק.

עם הדגירה, המעטפת הנגיפית וקרום התא מתמזגים, ומשחררים את הנוקלאוקפסיד הנגיפי הסוגר את הגנום הדו-גדילי לתוך הציטופלזמה. יתר על כן, הגנום הנגיפי משתחרר לגרעין התא.

באמצעות המנגנון התאי של המארח וחלבון הוויריון, הגנום הנגיפי מבטא חלבונים נגיפיים מוקדמים מיידיים, המווסתים את ביטוי הגנים המוקדמים. חלבונים נגיפיים מוקדמים מתווכים את שכפול ה-DNA הנגיפי.

לאחר מכן, גנים נגיפיים מאוחרים מבטאים חלבונים מבניים, אשר יחד עם הגנום הנגיפי מתאספים לייצור חלקיקי ויריון צאצאים. התאים הנגועים בנגיף משחררים ויריונים.

מתיל צלולוז מגביל את תנועת הנגיף, גורם לוויריונים להדביק רק את התאים השכנים ולאחר מכן ליזה, וליצור חורים בשכבה החד-שכבתית.

לאחר הדגירה, הסר את שכבת המתיל צלולוזה. הוסף תמיסת סגול קריסטל אתנולי. אתנול מקבע תאים ומשבית וירוסים, בעוד סגול קריסטל מכתים את התאים. כתוצאה מכך, אזורים או פלאקים ברורים מופיעים על השכבה החד-שכבתית של התא הסגול.

ספרו את הפלאק בכל באר בכל דילול וירוס כדי לקבוע את טיטר הנגיף או ריכוז הנגיף הזיהומי.

הסר את מדיום תרבית התאים מבאר אחת או שתיים באמצעות פיפטה. בזהירות, הוסף את דגימת הנגיף המדולל טיפה לכל שכבה אחת של תאים, טיפה דרך הצד של כל באר.

חזור על התהליך עבור כל באר אחת או שתיים עד שהצלחת כולה מתמלאת בדגימות הנגיף המנופחות. נדנד בעדינות את כל הצלחת ביד.

לאחר מכן, דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת כדי לאפשר ספיחה של הנגיף. לאחר כל 10 דקות, הוציאו את הצלחת מהחממה, נדנדו אותה בעדינות שוב כדי להפיץ את הנגיף בצורה אחידה יותר על פני כל באר, ולאחר מכן, החזירו אותה לחממה.

כדי להפחית את האפשרות לספור בטעות חיסון שלא נספג, הוציאו את דגימת הנגיף מהבארות באמצעות קצה פיפטה של 1,000 מיקרוליטר, והשליכו את הדגימה לכוס פסולת.

הניחו 2.5 מיליליטר של כיסוי מתיל צלולוז על הצלחת, והחזירו אותו לחממה. יש לחטא את הפסולת, בדרך כלל בתוספת אקונומיקה, יודופור או וירוס דומה, לפני הוצאתו מארון הבטיחות הביולוגית.

לאחר הדגירה בת היומיים, הסר את כיסוי המתיל צלולוז מבאר אחת או שתיים בכל פעם, בעזרת פיפטה, והניח אותה בכוס פסולת. הוסף כ -2 מיליליטר של 1% סגול קריסטל ו -50% אתנול לכל באר. דגרו את הצלחת עם כל הבארות המלאות בכתם למשך 30 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס.

בשלב זה יש לחטא את הפסולת, כפי שהודגם קודם לכן. שוטפים את הצלחות במרץ במי ברז, עד שהנגר צלול.

ודא שיש הבדלים של פי 10 בערך במספר הפלאקים בכל סדרת דילול.