אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 5:32 דק׳ • July 8th, 2025
תאי מארח נגועים בפתוגן מיקרוביאלי עוברים אפופטוזיס - מוות תאי מתוכנת. במהלך אפופטוזיס, DNases מפרקים את ה-DNA הכרומוזומלי לשברים קטנים, מה שמוביל למוות של תאים.
כדי לזהות אפופטוזיס באמצעות מבחן TUNEL, קח שקופית זכוכית עם קטע רקמת עור נטול פרפין ומיובש נגוע בפתוגן פטרייתי.
טפל ברקמה עם פרוטאינאז-K כדי לנטרל את ה-DNA התאי, ולמנוע מהם לפגוע ב-DNA במהלך הניתוח. הוסף מי חמצן כדי להרוות את התגובה, ושטוף את השקופית כדי להסיר חלבון-K שלא הגיב.
הוסף חוצץ המכיל טריפוספטים דאוקסי-אורידין עם תווית דיגוקסיגנין, או dUTPs. השלם אותו עם דאוקסינוקלאוטידיל טרנספראז טרמינלי, אנזים TdT ודגירה. בתאים אפופטוטיים, האנזים TdT מזרז את ההתקשרות של dUTPs מסומנים לקבוצות ה-3′-הידרוקסיל החשופות של ה-DNA המקוטע.
לאחר מכן, הוסף נוגדן אנטי-דיגוקסיגנין מצומד למדווח רודמין, ודגר אותו בחושך כדי להקל על קשירת נוגדנים ל-dUTPs המסומנים על ידי דיגוקסיגנין, מה שמעניק פלואורסצנטיות אדומה בעת ההדמיה.
טפל בדגימות הרקמה עם כתם נגד גרעיני פלואורסצנטי כדי לדמיין את הגרעינים. הנח כיסוי מעל קטע הרקמה, ודמיין אותו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
הקרינה הכחולה מסייעת בזיהוי הגרעינים של כל התאים בקטע הרקמה, בעוד שנוכחות של פלואורסצנציה אדומה בתאים המוכתמים ברודמין מעידה על פיצול DNA עקב אפופטוזיס.
כדי להתחיל בהליך זה, הכינו שקופיות זכוכ
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים