אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 5:32 דק׳ • July 8th, 2025
תאי מארח נגועים בפתוגן מיקרוביאלי עוברים אפופטוזיס - מוות תאי מתוכנת. במהלך אפופטוזיס, DNases מפרקים את ה-DNA הכרומוזומלי לשברים קטנים, מה שמוביל למוות של תאים.
כדי לזהות אפופטוזיס באמצעות מבחן TUNEL, קח שקופית זכוכית עם קטע רקמת עור נטול פרפין ומיובש נגוע בפתוגן פטרייתי.
טפל ברקמה עם פרוטאינאז-K כדי לנטרל את ה-DNA התאי, ולמנוע מהם לפגוע ב-DNA במהלך הניתוח. הוסף מי חמצן כדי להרוות את התגובה, ושטוף את השקופית כדי להסיר חלבון-K שלא הגיב.
הוסף חוצץ המכיל טריפוספטים דאוקסי-אורידין עם תווית דיגוקסיגנין, או dUTPs. השלם אותו עם דאוקסינוקלאוטידיל טרנספראז טרמינלי, אנזים TdT ודגירה. בתאים אפופטוטיים, האנזים TdT מזרז את ההתקשרות של dUTPs מסומנים לקבוצות ה-3′-הידרוקסיל החשופות של ה-DNA המקוטע.
לאחר מכן, הוסף נוגדן אנטי-דיגוקסיגנין מצומד למדווח רודמין, ודגר אותו בחושך כדי להקל על קשירת נוגדנים ל-dUTPs המסומנים על ידי דיגוקסיגנין, מה שמעניק פלואורסצנטיות אדומה בעת ההדמיה.
טפל בדגימות הרקמה עם כתם נגד גרעיני פלואורסצנטי כדי לדמיין את הגרעינים. הנח כיסוי מעל קטע הרקמה, ודמיין אותו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
הקרינה הכחולה מסייעת בזיהוי הגרעינים של כל התאים בקטע הרקמה, בעוד שנוכחות של פלואורסצנציה אדומה בתאים המוכתמים ברודמין מעידה על פיצול DNA עקב אפופטוזיס.
כדי להתחיל בהליך זה, הכינו שקופיות זכוכית הידרופיליות עם רקמת דגימה, כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
כדי לנטרל את חלקי הרקמות, יש לשטוף את השקופיות שלוש פעמים עם קסילן, למשך 5 דקות כל אחת, בצנצנת קופלין. לאחר מכן, שטפו את השקופיות עם 100% אתנול פעמיים למשך 5 דקות כל אחת. לאחר מכן, שטפו את המגלשות עם 95% אתנול, ו-70% אתנול, למשך 3 דקות כל אחת, ולאחר מכן שטפו את השקופיות פעם אחת עם PBS למשך 5 דקות.
להכנת שקופיות בקרה ניסיוניות ושליליות, טפל מראש ברקמה על ידי הוספת פרוטאינאז K מדולל טרי ישירות לשקופיות. דגרו את המגלשות למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן, שטפו את השקופיות ב-PBS פעמיים למשך 2 דקות כל אחת.
להכנת שקופיות בקרה חיוביות, טפל מראש ברקמה עם מאגר DN, ולאחר מכן דגר את השקופיות בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. לאחר מכן, DNase I מומס במאגר DN לריכוז סופי של 0.1 מיקרוגרם למיליליטר. הוסף את תמיסת ה- DNA המוכנה לשקופיות. דגרו את המגלשות למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שטפו את הדפנות במים מזוקקים בצנצנת קופלין חמש פעמים, למשך 3 דקות כל אחת.
להרוות את התגובה במי חמצן 3% ב-PBS למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את השקופיות ב-PBS פעמיים למשך שתי דקות כל אחת. לאחר מכן, הוסף מאגר שיווי משקל לרקמה שעל השקופיות. דגרו למשך 10 שניות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן, הקישו על עודפי הנוזל סביב חלק הרקמה.
לדלל את האנזים הטרמינלי דאוקסינוקלאוטידיל טרנספראז במאגר התגובה, ולאחר מכן, הוסף אותו לרקמה בשקופיות הבקרה הניסיוניות והחיוביות. דגירה בתא לח למשך שעה בחום של 37 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, הניחו את השקופיות בצנצנת קופלין המכילה את ריכוז העבודה של מאגר העצירה. מערבבים במשך 15 שניות, ולאחר מכן, מדגרים את השקופיות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר מכן, שטפו את השקופיות עם PBS שלוש פעמים למשך דקה אחת כל אחת, והקישו על עודפי הנוזל.
לאחר מכן, הוסיפו את המצומד נגד דיגוקסיגנין שחומם מראש לטמפרטורת החדר ישירות על הרקמה. דגרו את המגלשות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בתא חשוך ולח.
לאחר השלמת הדגירה, שטפו את השקופיות עם PBS ארבע פעמים למשך שתי דקות כל אחת. הקש על עודפי נוזלים. לאחר מכן, הוסף אמצעי הרכבה לצדדים. הוסף 15 מיקרוליטר של תמיסת DAPI למדיום ההרכבה בשקופיות. מכסים כל שקופית בכיסוי, ואוטמים בלק. הניחו למגלשות להתייבש בחושך.
בעזרת מיקרוסקופ פלורסנט, התבונן בשקופיות מיד עם סיום תהליך הצביעה.
צלם תמונות 400 פעמים במרווחי זמן אקראיים לאורך כל חלק של העור. ספור תאים כחולים מוכתמים ב-DAPI כדי להבטיח שלפחות 100 תאים לכל קטע עור, לכל בעל חיים, נראים לעין. לאחר מכן, ספרו את מספר התאים החיוביים ל-TUNEL המופיעים כתאים בודדים אדומים עם קצוות תאים ברורים.