JoVE Encyclopedia of Experiments
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 2:54 דק' • July 8th, 2025
Caspase-3 ו-caspase-7 הם פרוטאזות המזהות את רצף הטטרפפטיד של DEVD בחלבוני המטרה, ומבקעים אותם בקצה C של שאריות החומצה האספרטית. אלה ממלאים תפקיד בולט במפל האפופטוזיס - מוות תאי מתוכנת.
כדי להעריך את פעילות caspase-3/7 בתאים אפופטוטיים, התחל עם צינור המכיל צמח עור של בוהן צפרדע הנגוע בפטריות הגורמות לאפופטוזיס. הוסף חיץ מתאים לצינור וכמה חרוזים מתכתיים.
השתמש בהקצפת חרוזים כדי לשבש את תאי העור ולשחרר תוכן תאי, כולל חלבוני קספאז-3/7. צנטריפוגה בצינור, פסולת תאים ואברונים. שאפו את הסופרנטנט העשיר בחלבון מהצינור והפיפטה לבארות של צלחת בדיקה מרובת בארות.
השלם את הבארות עם מגיב הקספאז הלומינוגני. מגיב זה מורכב ממצע זוהר המכיל את פפטיד DEVD בתמיסה חוצצת המכילה ATP, יוני מגנזיום ואנזים לוציפראז.
מערבבים את תכולת הבאר ודוגרים. במהלך הדגירה, קספאז-3/7 מבקע את המצע הזוהר, ומשחרר אמינולוציפרין - מצע ללוציפראז - לתמיסה.
בנוכחות יוני ATP ומגנזיום, לוציפראז מחמצן את האמינולוציפרין המשוחרר, ויוצר מוצר ביולומינסנצינטי. כמות האור המופקת במהלך התגובה פרופורציונלית לפעילות הקספאז.
כדי לחלץ חלבונים מדגימת בוהן צפרדע קפואה, הנח את הדגימה בצינור מיקרוצנטריפוגה של מכסה בורג של 1.5 מיליליטר, המכיל 100 מיקרוליטר של מאגר דגימה ושני חרוזי נירוסטה.
השתמש במקצף חרוזים במהירות מקסימלית כדי לליז את התאים. לאחר מכן, הניחו את הצינור על קרח למשך 3 דקות, ולאחר מכן, צנטריפוגה את הצינור כדי לאסוף את הסופרנטנט.
כדי לבצע את בדיקת הקספאז 3/7 בצלחת של 384 בארות, הוסף 10 מיקרוליטר של מאגר דגימה כריק, ו-10 מיקרוליטר תמצית חלבון בשלוש עותקים. לאחר מכן, פיפטה 10 מיקרוליטר של מגיב קספאז 3/7 זמין מסחרית לתמצית החלבון ולבארות ריקות. לאחר מכן, יש לנער את הצלחת בעדינות למשך 15 שניות כדי לערבב את שני הריאגנטים.
דוגרים בטמפרטורת החדר וחשוכים למשך 30 דקות. לבסוף, השתמש בקורא צלחות זוהר כדי למדוד את הזוהר של הדגימה.