JoVE Encyclopedia of Experiments
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 4:48 דק' • July 8th, 2025
מקרופאגים הם תאים חיסוניים מיוחדים שמנקים את התאים שעוברים אפופטוזיס - מוות תאי מתוכנת על ידי פגוציטוזיס.
כדי להעריך את בליעת התאים האפופטוטיים, התחל עם שקופית זכוכית המכילה תאים עובריים קבועים של דרוזופילה, כולל גופים אפופטוטיים שנבלעו על ידי המוציטים - מקרופאגים חסרי חוליות.
ראשית, טפל בתאים עם מגיב חוסם שחוסם את האתרים הלא ספציפיים. הוסף נוגדנים ראשוניים הקושרים את קולטני הקרוקומרט - סמנים פגוציטים של המוציטים. שטפו את עודפי הנוגדנים.
הוסף נוגדנים משניים המסומנים בפוספטאז אלקליין הנקשרים לנוגדנים הראשוניים. כעת, הוסף תמיסת מצע כרומוגנית מתאימה על השקף, ודגירה. במהלך הדגירה, פוספטאז אלקליין מגיב עם המצע הכרומוגני כדי להניב גרגירים מוכתמים בסגול בהמוציטים.
לאחר מכן, הוסף תערובת תגובה הכוללת טרנספראז דאוקסינוקלאוטידיל טרנספראז, אנזים TdT ונוקלאוטידים הקשורים לדיגוקסיגנין. TdT מזרז את ההצמדה של נוקלאוטידים הקשורים לדיגוקסיגנין לקצוות ה-3' OH החשופים של ה-DNA המפוצל בגופים האפופטוטיים.
לאחר מכן, הוסף נוגדנים אנטי-דיגוקסיגנין מצומדים למדווח פרוקסידאז הנקשרים לנוקלאוטידים באתר הנזק ל-DNA. לטפל בתאים בתמיסת סובסטרט כרומוגני ספציפי לפרוקסידאז, ולדגור. פרוקסידאז מזרז את חמצון המצע, יוצר משקעים צבעוניים ומכתים את הגופים האפופטוטיים בחום.
לבסוף, דמיינו את התאים תחת מיקרוסקופ אור. הנוכחות המשותפת של גרגירים סגולים ואותות חומים מהתאים מצביעה על המוציטים המכילים גופים אפופטוטיים פגוציטוזיים.
כדי להכתים את התאים בנוגדנים נגד קרוקמורט, ראשית, יש להשרות את השקף באופן סדרתי במתנול, לאחר מכן PBS בתוספת 0.2% טריטון X-100, ולאחר מכן PBS בלבד. לאחר מכן, חסום את הקישור הלא ספציפי עם 20 מיקרוליטר של 5% סרום חזירים שלמים ב-PBS + 0.2% Triton X-100, למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את תמיסת החסימה העודפת, וסמן את התאים ב-20 מיקרוליטר של אנטי-קרוקמורט ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
למחרת בבוקר, שטפו את המגלשה ב-PBS + Triton X-100 למשך חמש דגירות של 10 דקות. לאחר הכביסה האחרונה, שטפו את השקופית ב-PBS למשך 10 דקות. לאחר מכן, סמנו את התאים ב-20 מיקרוליטר של IgG אנטי-חולדות אלקליין עם תווית פוספטאז בטמפרטורת החדר למשך שעה.
בתום הדגירה, שטפו את המגלשה חמש פעמים ב-PBS + Triton X-100 כפי שהודגם, ולאחר מכן השרייה של 10 דקות בתמיסת חיץ. לאחר מכן, סמנו את התאים בתמיסת מצע פוספטאז, והתבוננו בתאים תחת מיקרוסקופ אור.
כאשר מופיעים אותות סגולים חזקים בגרגירי ההמוציטים, הסר את המצע העודף והשרו את השקופית במאגר בתוספת EDTA למשך 5 עד 10 דקות. בתום הדגירה יש לשטוף את התאים בשתי שטיפות PBS של 5 דקות, ולטפל בהם במאגר שיווי משקל למשך 10 דקות.
לאחר הסרת התמיסה, סמן את התאים ב-20 מיקרוליטר של תמיסת דאוקסינוקלאוטידיל טרנספראז טרמינלית ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר מכן, הסר את התמיסה מהשקופית, והשרו את התאים במאגר עצירת כביסה של 0.5 מיליליטר ב -17 מיליליטר מים, למשך 10 דקות. לאחר מכן, שטפו את התאים בשלוש שטיפות PBS של 5 דקות, וסמנו אותם ב-20 מיקרוליטר של אנטי-דיגוקסיגנין פרוקסידאז למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
בתום הדגירה, שטפו את התאים ארבע פעמים ב-PBS, כפי שהודגם, והשרו את השקופית במצע פרוקסידאז למשך 30 שניות עד שהתאים האפופטוטיים הופכים לחומים. כאשר הושגה צביעה אופטימלית, יש להשרות את המגלשה במים כדי לעצור את תגובת הפרוקסידאז.