אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 7:16 דק׳ • July 8th, 2025
ביציות בפרופאזה-I של מיוזה פעילות מבחינת שעתוק; הן מייצרות mRNA ומאחסנות אותן בצורה רדומה. במהלך ההתבגרות, כאשר הביצית נכנסת למטאפאזה, ה-mRNA המאוחסנים מתורגמים לחלבונים.
כדי לחקור את התרגום של mRNA, התחל עם ביציות עכברים שנעצרו בפרופאזה I תלויות בטיפת מדיום. מקם את פיפטת האחיזה ליד ביצית בודדת כדי להחזיק אותה במקומה.
קח פיפטה מיקרו-הזרקה המכילה תערובת עיתונאי. תערובת זו מכילה שני סוגים נפרדים של mRNA, האחד מקודד חלבון פלואורסצנטי צהוב, או YFP - מדווח המותך עם האזור הלא מתורגם 3' של גן המטרה - ו-mRNA פוליאדניל המקודד חלבון פלואורסצנטי אדום.
הזריקו את תערובת הכתבים לתוך הביצית. דגרו את הביציות המוזרקות במדיום התבגרות בתוספת צילוסטמיד - מעכב כימי השומר על מעצר פרופאזה-I.
הביצית מתרגמת mRNA פוליאדניל עד שעוצמת הקרינה האדומה מגיעה למישור, בעוד שרמות ה-mRNA המקודד YFP חסר זנב פוליאדנילציה נשארות ככאלה.
מעבירים את הביציות המטופלות למדיום התבגרות ללא צילוסטמיד, המסייע לחידוש המיוזה; וה-mRNA המטרה עובר תרגום כדי לייצר את חלבון המטרה המותך עם מדווח פלואורסצנטי צהוב.
בצע הדמיית זמן-lapse כדי לדמיין את אותות הקרינה במרווחי זמן קבועים.
ביציות מוזרקות מראות רמות קבועות של פלואורסצנטיות אדומה, בעוד שהפלואורסצנציה הצהובה עולה עם הזמן, מה שמעיד על תרגום והצטברות הדרגתית של החלבונים המדווחים.
כדי ל
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים