אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 7:16 דק׳ • July 8th, 2025
ביציות בפרופאזה-I של מיוזה פעילות מבחינת שעתוק; הן מייצרות mRNA ומאחסנות אותן בצורה רדומה. במהלך ההתבגרות, כאשר הביצית נכנסת למטאפאזה, ה-mRNA המאוחסנים מתורגמים לחלבונים.
כדי לחקור את התרגום של mRNA, התחל עם ביציות עכברים שנעצרו בפרופאזה I תלויות בטיפת מדיום. מקם את פיפטת האחיזה ליד ביצית בודדת כדי להחזיק אותה במקומה.
קח פיפטה מיקרו-הזרקה המכילה תערובת עיתונאי. תערובת זו מכילה שני סוגים נפרדים של mRNA, האחד מקודד חלבון פלואורסצנטי צהוב, או YFP - מדווח המותך עם האזור הלא מתורגם 3' של גן המטרה - ו-mRNA פוליאדניל המקודד חלבון פלואורסצנטי אדום.
הזריקו את תערובת הכתבים לתוך הביצית. דגרו את הביציות המוזרקות במדיום התבגרות בתוספת צילוסטמיד - מעכב כימי השומר על מעצר פרופאזה-I.
הביצית מתרגמת mRNA פוליאדניל עד שעוצמת הקרינה האדומה מגיעה למישור, בעוד שרמות ה-mRNA המקודד YFP חסר זנב פוליאדנילציה נשארות ככאלה.
מעבירים את הביציות המטופלות למדיום התבגרות ללא צילוסטמיד, המסייע לחידוש המיוזה; וה-mRNA המטרה עובר תרגום כדי לייצר את חלבון המטרה המותך עם מדווח פלואורסצנטי צהוב.
בצע הדמיית זמן-lapse כדי לדמיין את אותות הקרינה במרווחי זמן קבועים.
ביציות מוזרקות מראות רמות קבועות של פלואורסצנטיות אדומה, בעוד שהפלואורסצנציה הצהובה עולה עם הזמן, מה שמעיד על תרגום והצטברות הדרגתית של החלבונים המדווחים.
כדי להתחיל, פתח בזהירות את הזקיקים האנטרליים על ידי ביצוע חתך קטן בדופן הזקיק בעזרת מחט בגודל 26. בודד COCs שלמים עם מספר שכבות של תאי קומולוס באמצעות פיפטת זכוכית המופעלת בפה. השתמש בפיפטה קטנה יותר והפחית מכנית את ה-COCs על ידי פיפטינג חוזר ונשנה.
שאפו את הביציות הנטולות, והניחו אותן בצלחת פטרי עם מדיום התבגרות בתוספת 1 מיקרומולר של צילוסטמיד. מניחים את המנה באינקובטור למשך שעתיים, כדי לאפשר לביציות להתאושש מהלחץ הנגרם מבידודן מהזקיקים.
הנח צינור נימי זכוכית בורוסיליקט באורך 10 סנטימטרים, ומושך מכני להכנת מחטי הזרקה. כופפו את קצה המחט בזווית של 45 מעלות באמצעות נימה מחוממת להזרקה אופטימלית. מניחים טיפות של 20 מיקרוליטר של מדיום איסוף ביציות בסיסי בכלי פוליסטירן, ומכסים את הטיפות בשמן מינרלי קל.
הכן נפח גדול יותר של תערובת כתבים על ידי הוספת 12.5 מיקרוגרם למיקרוליטר של Ypet UTR ו-mCherry כל אחד. אחסן כמויות של אלה במינוס 80 מעלות צלזיוס. לאחר ההפשרה, צנטריפוגה את האליקוטה למשך שתי דקות ב-20,000 x גרם. לאחר מכן, העבירו אותו לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש.
טען את מחט ההזרקה בכ-0.5 מיקרוליטר של תערובת מדווח. הנח את פיפטת האחיזה ואת מחט ההזרקה לתוך המחזיקים, ומקם אותם בטיפה של מדיום איסוף הביציות.
פתח את מחט ההזרקה על ידי הקשה עדינה על פיפטת האחיזה. מניחים ביציות בטיפה של מדיום איסוף בסיסי, ומזריקים 5 עד 10 פיקוליטר מתערובת הכתב. דגרו את הביציות בתווך ההתבגרות עם 1 צילוסטמיד מיקרו-מולרי למשך 16 שעות כדי לאפשר לאות ה-mCherry להתייצב.
למיקרוסקופ זמן-lapse, הכינו צלחת פטרי עם שתי טיפות של 20 מיקרוליטר של מדיום התבגרות עבור כל מדווח מוזרק. טיפה אחת עם צילוסטמיד מיקרו-מולרי אחד לבקרת ביציות שנעצרו בפרופאזה I, וטיפה אחת ללא צילוסטמיד לביציות מתבגרות. מכסים את הטיפות בשמן מינרלי קל, ומניחים אותן בחממה.
לאחר הדגירה המוקדמת, הוציאו את הביציות שהוזרקו מהחממה, ושטפו אותן ארבע פעמים במדיום התבגרות ללא צילוסטמיד. שמור כמה ביציות במדיום התבגרות עם 1 צילוסטמיד מיקרו-מולרי כקבוצת ביקורת ביצית פרופאזה-I.
העבירו את הביציות המוזרקות לטיפות המתאימות שלהן על צלחת המיקרוסקופ שהוכנה קודם לכן. אשכול את הביציות עם פיפטת זכוכית סגורה כדי למנוע את תנועתן במהלך ההקלטה.
הניחו את המנה מתחת למיקרוסקופ המצוידת במערכת תאורת דיודות פולטות אור, ובמה ממונעת המצוידת בתא סביבתי הנשמר ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני, תוך שימוש בפרמטרים המוזכרים בכתב היד הטקסטואלי.
הזן את ההגדרות המתאימות לניסוי זמן-lapse על ידי לחיצה על "אפליקציות" ולאחר מכן, "רכישה רב-ממדית". בחר בכרטיסייה הראשונה "ראשי" ובחר "זמן-lapse", "מיקומי שלבים מרובים" ו"אורכי גל מרובים".
בחר בכרטיסייה "שמירה" כדי להזין את המיקום שבו יש לשמור את הניסוי. לאחר מכן, בחר בכרטיסייה "זמן-lapse" כדי להזין את מספר נקודות הזמן, משך הזמן ומרווח הזמן. בחר בכרטיסייה "במה". הפעל את brightfield ואתר את מיקום הביציות על ידי פתיחת חלון חדש ובחירה באפשרות "רכישה", "רכישה" ו"הצג בשידור חי".
לאחר איתור הביציות, חזור ל"חלון הרכישה הרב-ממדי" ולחץ על "+" כדי להגדיר את מיקום הביציות. בחר בכרטיסייה "אורכי גל" והגדר שלושה אורכי גל שונים עבור שדה בהיר, YFP ו-mCherry. התאם את החשיפה עבור Ypet ו-mCherry. לאחר מכן, התחל את ניסוי ה-Time-lapse על ידי לחיצה על "רכוש".
לניתוח תרגום Ypet-3' UTR, בצע שתי מדידות אזור עבור כל ביצית. הביצית עצמה על ידי גזירה על "אזור אליפסה", ואזור קטן המקיף את הביצית שישמש לחיסור רקע על ידי לחיצה על "אזור מלבני". ייצא את נתוני מדידת האזור לגיליון אלקטרוני על ידי לחיצה על "פתח יומן" ולאחר מכן על "נתוני יומן".
עבור כל ביצית בודדת ועבור כל נקודות הזמן הנמדדות, הפחיתו את מדידת אזור הרקע ממדידת אזור הביציות בנפרד עבור אורכי גל YFP ו-mCherry .