alamarBlue Assay: שיטה פלואורומטרית רגישה לסינון ההשפעות ציטוטוקסיות של פורמולציות דמעות מלאכותיות על הפעילות המטבולית של תאי אפיתל בקרנית אנושיים

שכבת הדמעות - נוזל ההגנה המכסה את העין - מסייעת בשימון ובשמירה על תאי אפיתל קרנית העין, CECs, במצב בריא ופעיל מטבולית. שכבת דמעות פגומה, כמו במחלת עין יבשה, עלולה לגרום לאידוי דמעות מ-CECs, ולהגביר את רגישותם לזיהום ולנזק דלקתי.

פורמולציות דמעות מלאכותיות מייצבות את שכבת הדמעות ומשפרות את אגירת המים, ומונעות התייבשות תאים.

כדי לסנן את ההשפעות הציטוטוקסיות של ניסוח דמעות מלאכותיות לבדיקה על CECs באמצעות בדיקת alamarBlue, התחל בתרבית דבקה של CECs שמקורם באדם במדיה מתאימה. השלך את המדיה.

דגרו על תרבית התאים בריכוז ספציפי של פורמולציית הדמעות המלאכותיות. נוסחת הדמעות יוצרת ציפוי מעל התאים. בהתאם להשפעה המצטברת של המרכיבים המרכיבים, התאים עלולים לחוות אובדן בפעילות המטבולית.

לאחר מכן, הוסף תמיסת alamarBlue המכילה רזזורין, צבע בצבע כחול, פלואורסצנטי חלש, לא רעיל, מסיס במים.

רזזורין מתפזר לתאים ומצטמצם באופן בלתי הפיך בתאים פעילים מטבולית בעיקר על ידי רדוקטאזות מיטוכונדריאליות מכיוון שהוא מקבל אלקטרונים מתורמי האלקטרונים של תהליכי הנשימה-חילוף החומרים, ויוצר רסורופין בצבע ורוד ופלואורסצנטי מאוד, הנע בחופשיות מהתאים לתוך התמיסה. העבירו את התמיסה המכילה רסורופין לצלחת מרובת בארות טרייה.

בעזרת קורא לוחות פלואורסצנטי, מדוד את עוצמת הקרינה. ערך עוצמת פלואורסצנטי נמוך מצביע על פעילות מטבולית תאית נמוכה, מה שמרמז על השפעות לא רצויות של ניסוח הדמעות על CECs.

הסר את אמצעי התרבות מהבארות, וטפל מיד בתאים עם 150 מיקרוליטר של ניסוח בדיקה או תמיסת בקרת מדיה. לאחר מכן, דגרו על התאים למשך 30 דקות.

הסר את תמיסת הבדיקה מהתאים, והוסף 0.5 מיליליטר של תמיסת צבע מטבולית של 10%. דגרו על התאים למשך ארבע שעות נוספות.

לאחר הדגירה, הוציאו 100 מיקרוליטר תמיסת צבע מכל באר והעבירו אותה לצלחת של 96 בארות. השתמש בקורא צלחות כדי למדוד את הקרינה של כל באר, הגדר את העירור ל-540 ננומטר ואת הפליטה ל-590 ננומטר.