בדיקת חלבון מסיס לכימות תכולת חלבון מסיס ברקמות צמחים

כדי לכמת את תכולת החלבון המסיס ברקמת הצמח, בצינור, התחל בכמות מתאימה של רקמת צמח טחונה, ליופילית.

הוסף נתרן הידרוקסיד, אלקלי, לצינור וסוניקט. הסביבה האלקליין עם הכוחות המכניים משבשת את התאים, ומשחררת תוכן תוך תאי, כולל מקרומולקולות - חלבונים מסיסים ופחמימות. דגירה בטמפרטורות גבוהות יותר.

בנוכחות חום, אלקלי גורם להידרוליזה של חלבון, יוצר פפטידים קטנים יותר ומגביר את מסיסות החלבון. בנוסף, פחמימות מתכלות.

צנטריפוגה את התערובת. אסוף את הסופרנטנט המכיל חלבון מסיס. הוסף חומצה הידרוכלורית כדי לנטרל את ה-pH.

טפל בדגימה בחומצה טריכלורואצטית, TCA. TCA משבש את מעטפת ההידרציה המקיפה את החלבונים, מה שמוביל לצבירת חלבונים ומשקעים.

צנטריפוגה והסר את הסופרנטנט המכיל TCA. שטפו את כדור החלבון באצטון קר כקרח כדי להסיר שאריות TCA, שעלולות להפריע להערכת חלבון מסיס.

יבש את האצטון באוויר. השעו מחדש את כדור החלבון בנתרן הידרוקסיד. לדלל במים נטולי יונים. מעבירים לבארות של צלחת מרובת בארות.

הוסף תמיסה חומצית של צבע Coomassie Brilliant Blue G-250. בתנאים חומציים, הצבע נקשר לשאריות חומצות האמינו הבסיסיות בחלבונים המסיסים, וכתוצאה מכך קומפלקס חלבון-צבע כחול.

השתמש בספקטרופוטומטר כדי למדוד את הספיגה של קומפלקס החלבון-צבע, פרופורציונלי לתכולת החלבון המסיס ברקמת הצמח.

כדי להתחיל, שקלו דגימות משוכפלות של כל רקמה לתוך צינורות מיקרו-צנטריפוגה מסומנים של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, רשום את המסה המדויקת של כל דגימה. בעזרת מיקרו-פיפטור מוסיפים 500 מיקרוליטר של 0.1 נתרן הידרוקסיד מולארי לכל צינור. סגרו את המכסים בחוזקה, והפכו את הצינורות לסוניקציה למשך 30 דקות.

לאחר מכן, הניחו את הצינורות באמבט מים חמים שחוממו מראש למשך 15 דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה את הצינורות ב -15,000 גרם למשך 10 דקות. פיפטה את הסופרנטנט לתוך צינורות מיקרו-צנטריפוגה מסומנים חדשים באמצעות קצה פיפטה חדש לכל דגימה.

הוסף לגלולה 300 מיקרוליטר של 0.1 נתרן הידרוקסיד מולארי, וחזור על הצנטריפוגה למשך 10 דקות. לאחר מכן, הסירו את הסופרנטנט והעבירו אותו לצינורות המכילים את הסופרנטנט מהצנטריפוגה הראשונה.

כדי לנטרל את ה- pH של הסופרנטנט, הוסף 11 מיקרוליטר של חומצה הידרוכלורית 5.8 מולארית. השתמש בנייר לקמוס כדי לאשר שה-pH הוא כ-7.

לאחר מכן, הוסף 90 מיקרוליטר של 100% חומצה טריכלורואצטית לכל צינור. לאחר מכן, דגרו את הצינורות על קרח למשך 30 דקות. צנטריפוגה של הדגימות ב-13,000 גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. בזהירות, השתמש בקו ואקום ובקצה מיקרופיפטה מזכוכית כדי להסיר את החומצה הטריכלורואצטית.

היזהר מאוד לא להפריע לגלולה עם קצה היניקה.

לאחר מכן, שטפו את הגלולה עם 100 מיקרוליטר אצטון מקורר ל -20 מעלות צלזיוס שליליות. לאחר מכן, אפשר לאצטון להתאדות במכסה אדים. ממיסים את כדור החלבון עם 1 מיליליטר נתרן הידרוקסיד. ייתכן שיידרשו סבבים נוספים של חימום, מערבולת וסוניקציה.

הוסף 160 מיקרוליטר מכל תמיסה סטנדרטית של IgG לצלחת של 96 בארות במשולש, החל ממצב A1. לאחר מכן, בשפופרת חדשה של 1.5 מיליליטר, הוסף 50 מיקרוליטר מכל תמיסת דגימה ל-950 מיקרוליטר מים מזוקקים. לאחר מכן, הוסף 60 מיקרוליטר מכל דגימה מדוללת לצלחת הבאר בשלוש עותקים, החל ממצב H1. הוסף 100 מיקרוליטר מים מזוקקים לכל בארות הדגימה הריקות והלא ידועות.

בעזרת פיפטה רב-ערוצית, הוסף 40 מיקרוליטר של צבע חלבון G-250 כחול מבריק של Coomassie לכל באר בצלחת. בעזרת מחט, פוצץ את כל הבועות הקיימות בבארות. לאחר מכן, אפשר לצלחת לדגור בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. לאחר מכן, השתמש בספקטרופוטומטר מיקרו-פלייט כדי לרשום את ערכי הספיגה עבור כל באר ב-595 ננומטר.