בדיקת גדילה מבוססת לוציפראז לכימות רבייה תוך תאית של טפיל

טוקסופלזמה גונדי - פרוטוזואן חד-תאי - הוא טפיל אנאירובי מחייב, המתרבה רק בתוך תאי המארח.

כדי לכמת את הצמיחה התוך תאית של הטפיל באמצעות בדיקה מבוססת לוציפראז, קח תרחיף של תאי טפיל המבטאים לוציפראז - אנזים המייצר זוהר בתגובה עם המצע שלו. הוסף את התרחיף לתרבית של פיברובלסטים של עורלה אנושית, ודגר למשך זמן מתאים.

הטפיל נקשר לקולטני התא המארח ומופנם בתהליך אנדוציטי, ויוצר ואקואול טפילי. המבנה מספק נישה לטפיל להתרבות.

לאחר ההדבקה, שאפו את המדיום, הסירו את הטפילים הלא מופנמים. הוסף מאגר ליזה המכיל חומר ניקוי ולוציפרין - מצע ללוציפראז. חומר ניקוי במאגר יוצר נקבוביות בקרום התא ומבצע ליזה מלאה של התאים, וכתוצאה מכך שחרור לוציפראז.

האנזים המשוחרר מחמצן מולקולות לוציפרין ופולט אור. מדוד את עוצמת הזוהר כדי לקבוע את פעילות הלוציפראז. באמצעות בארות משוכפלות המכילות תאי מארח נגועים, מדוד את פעילות הלוציפראז במרווחי זמן קבועים מראש לאחר ההדבקה.

שרטט את עוצמת הזוהר המנורמל לעומת מרווחי הזמן כדי לקבל את שינויי הקפל בצמיחת הטפילים לאורך זמן. עלייה זמנית בעוצמה מעידה על התרבות טפילים מוצלחת.

התווה את הערכים בקנה מידה לוגריתמי כדי לחשב את שיפוע העקומה, המייצג את זמן ההכפלה של הטפיל.

כדי לבצע בדיקת גידול טוקסופלזמה מבוססת לוציפראז, התחל בשאיבת המדיום בזהירות מתרביות מיקרו-פלטות של 96 בארות שנזרעו מראש של פיברובלסטים של עורלה אנושית, וחסן 150 מיקרוליטר של תרחיף נטול טפילים לבארות בפורמט של שלוש עמודות וחמש שורות.

לאחר דגירה של ארבע שעות בחממת תרבית התאים, שאפו בזהירות את המדיום מכל באר כדי להסיר את הטפילים שלא פלשו, ומלאו את הבארות בכל שורה מלבד הראשונה במדיום נטול אדום פנול בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת מצע לוציפראז מיקרו-מולרית 12.5 ב-PBS לכל באר בשורה העליונה, ודגר את המיקרו-לוחות למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר ליזה מלאה של תאים.

בסוף הדגירה, מדוד את פעילות הלוציפראז בקורא מיקרו-פלטות. כל קריאה מייצגת את המספר הראשוני של טפילים שפלשו ארבע שעות לאחר ההדבקה. חזור על הניתוח כל 24 שעות במשך ארבעת הימים הבאים מבלי לשנות את המדיום.

כדי לחשב את שינוי הקפל המנורמל של גידול הטפילים, ניתן לחלק כל קריאה בקריאה הראשונית ארבע שעות לאחר ההדבקה. לאחר מכן ניתן לשרטט את ה-log2 של שינוי הקפל המנורמל של צמיחת הטפיל כנגד כל נקודת זמן, ולהכפיף אותו לפונקציית רגרסיה ליניארית כדי לקבל את השיפוע, המייצג את זמן ההכפלה.