אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 4:14 דק׳ • July 8th, 2025
Msp1, ATPase בקרום החיצוני המיטוכונדריאלי, מסיר חלבונים מעוגנים בזנב, או TA, מהממברנה דרך הנקבוביות המרכזיות ההקסמריות שלה, מה שמקל על פירוקם.
כדי להבין את מנגנון הטרנסלוקציה, יש להרכיב מחדש חלבוני TA ו-Msp1 לליפוזומים, ולאפשר את שילובם בשכבת השומנים הדו-שכבתית.
הכינו תערובת תגובה על ידי הוספת הליפוזומים המחודשים למאגר מתאים המכיל צ'פרונים - חלבוני בקרת איכות ציטוזוליים. המלווים מתויגים באנזים גלוטתיון-S-טרנספראז או GST.
הוסף אדנוזין טריפוספט - ATP - לתגובה. ה-Msp1 נקשר למולקולות ה-ATP ומבצע הידרוליזה שלהן. באמצעות אנרגיה שנוצרת על ידי הידרוליזה, Msp1 מעביר את חלבוני TA הקשורים לממברנה דרך הנקבובית המרכזית שלו. המלווים בתערובת התגובה נקשרים לתחום הטרנסממברני של חלבוני ה-TA המופקים.
לאחר מכן, טען את תערובת התגובה על עמודת טיהור זיקה. העמוד מכיל שרף מצומד עם גלוטתיון מופחת או GSH. חלבון ה-GST על המלווים נקשר ל-GSH המצומד - המצע שלו - ומחבר את קומפלקסי החלבון צ'פרון-TA לשרף.
סובב את העמודה כדי להסיר את חלבוני TA שעדיין משולבים בליפוזומים. כעת, הוסף מאגר פליטה המכיל עודף של GSH. מולקולות ה-GSH החופשיות מחליפות באופן תחרותי את הקישור בין GST ל-GSH מצומד.
הסר את קומפלקסי החלבון chaperone-TA המשוחררים עם המאגר. נתח את ה-eluate כדי לאשר את נוכחותם של חלבוני TA, המציין את הסרתם מהליפוזומים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים