בדיקה מבוססת צלחת למדידת שחרור מונואמין מפרוסות מוח בחשיפה לתרופות בדיקה

נוירוטרנסמיטורים מונואמינים, שליחים כימיים אנדוגניים, מעבירים אותות על פני הסינפסה, נקודת המגע בין נוירונים. מערכת נוירוטרנסמיטורים מונואמין מווסתת היטב חיונית לתפקוד תקין של תאי עצב.

כדי לסנן את ההשפעה של תרופת בדיקה על שחרור מונואמין ex vivo, השג פרוסות רקמת מוח של חולדות המכילות את אזור העניין במאגר מחומצן מקורר, תוך שמירה על כדאיות הרקמות.

העבירו את פרוסות הרקמה לבארות של צלחת מרובת בארות, עם תוספות פילטר נקבוביות המחוברות לאספקת תערובת גזית וכוללות נוזל מוחי מלאכותי מחומצן, aCSF, בתוספת מעכבי מונואמין אוקסידאז. דגירה.

המעכבים מתפזרים לתאים ומנטרלים אנזימי מונואמין אוקסידאז, מונעים פירוק של מונואמינים ומגדילים את ריכוזם הזמין לאחסון ושחרור.

העבירו את התוספות המכילות רקמות לבארות המכילות aCSF מחומצן, ואת תרופת הבדיקה. דגירה. התרופה עשויה לעורר את מערכת המוליכים העצביים של מונואמין, להגדיל את ריכוז המונואמין בחלל החוץ-עצבי, מה שמוביל לשחרורם מרקמת המוח לתמיסה.

המונואמינים המשוחררים עוברים דרך התוספות הנקבוביות לבארות, ונפרדים מהרקמה.

לאחר הדגירה, הסר את התוספות המכילות פרוסת רקמה. אסוף את תמיסת המונואמין בצינור המורכב מממס התואם לכרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים, HPLC. העבירו את תכולת הצינור ליחידות סינון שהורכבו מראש. צנטריפוגה, הסרת מזהמים עיקריים.

טען את המסנן שהתקבל לעמודת HPLC ובצע ריצת כרומטוגרפיה כדי לקבוע את ריכוז המונואמין, המעיד על השפעת תרופת הבדיקה על שחרור מונואמין.

כדי לגרום לשחרור מונואמין, העבירו את דגימות הרקמה לכל באר של תא פליטה של 48 בארות בהתאמה אישית, המכיל 0.5 עד 1 מיליליטר של מאגר פליטה לבאר עם בעבוע קבוע ועדין, ואפשר לדגימות להתאושש במשך 30 עד 50 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.

בתום תקופת שיווי המשקל, העבירו את מחזיק הרקמה עם רקמת המוח, לבארות המכילות 500 מיקרוליטר של מאגר פליטה מחומצן עם או בלי חומר תרופתי, הקישו על המחזיק בקצה הבאר כדי למנוע העברה מינימלית של חיץ בין בארות, לדגירה של 20 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

בתום הדגירה, העבירו את המחזיק לסט בארות חדש המכיל 500 מיקרוליטר של מאגר פליטה עם או בלי התרופה המעניינת, והחזירו את הצלחת לחממת תרבית התאים, למשך 20 דקות נוספות.

במהלך הדגירה השנייה, העבירו את התמיסה מהבארות מהדגירה הראשונה לצינורות מיקרו-צנטריפוגה המכילים 50 מיקרוליטר של 1 N חומצה פרכלורית או זרחתית על קרח, וסמנו את הצינורות #1.

בסוף הדגירה השנייה, העבירו את מחזיק הרקמה לבארות ריקות עם הצלחת על קרח, והעבירו את הסופרנטנטים מהדגירה השנייה לצינורות מיקרו-צנטריפוגה חדשים המכילים 50 מיקרוליטר של 1 N חומצה פרכלורית או זרחתית, על קרח. סמן את הצינורות האלה #2.

כאשר כל הסופרנטנטים הועברו, הוסיפו מיליליטר אחד של מאגר דיסקציה קר כקרח לכל באר של רקמה, והשתמשו בפינצטה קטנה כדי להעביר כל דגימת רקמה לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש. הסר את המאגר מצינורות הדגימה, ואחסן את הרקמות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, העבירו את תמיסות הדגירה שנאספו לצינורות סינון מיקרו-צנטריפוגות לצנטריפוגה, והניחו את המסנן על קרח, עד לניתוח HPLC.