בדיקת הסתיידות למדידת ריכוז הסידן בתאים אינטרסטיציאליים של מסתם אבי העורקים

עלוני מסתם אבי העורקים מכילים אוכלוסייה הטרוגנית של תאי ביניים של שסתומים, או VICs, המפוזרים בכל שכבות המטריצה החוץ-תאיות. עם הגירוי, VICs הופכים לאוסטאובלסטים - תאים יוצרי מטריצת עצם.

אוסטאובלסטים בוגרים מפרישים קולגן וחלבוני מטריצת עצם. חלבונים אלה מסייעים לאוסטאובלסטים להיצמד למטריצה. לבסוף, יוני סידן תוך-תאיים נכנסים לסביבת המטריצה ויחד עם פוספטים משקעים כגושים מינרליים, מה שמוביל להסתיידות שסתום אבי העורקים.

כדי להעריך את ריכוז הסידן במסתמי אבי העורקים המסויידים, התחל בתרבית של VICs בצלחת של שש בארות. השליכו את מדיום התרבות, הוסיפו מדיום אוסטאוגני לבאר ודגרו.

במהלך הדגירה, אינסולין בתווך האוסטיאוגני מגרה את ה-VICs להתמיין לפנוטיפים אוסטאוגניים. אוסטאובלסטים אלה מפרישים חלבוני מטריצת עצם וחומצה אסקורבית בתווך האוסטיאוגני, מה שגורם להם ליצור מטריצה חוץ-תאית עשירה בקולגן.

לבסוף, הסידן התוך-תאי של האוסטאובלסטים והפוספטים של המדיום יוצרים גבישים מינרליים במדיום.

הסר את המדיום והוסף את תמיסת החומצה ההידרוכלורית. דגירה כדי להמיס את יוני הסידן לתמיסה. הוצא את המדיום החומצי המכיל סידן לבאר של צלחת מרובת בארות.

מוסיפים צבע רגיש לסידן, ודוגרים. מולקולות הצבע נקשרות ליוני הסידן בתווך החומצי, ויוצרות קומפלקס סידן בצבע סגול.

מדוד את ספיגת הקומפלקס, שהיא פרופורציונלית לריכוז הסידן בדגימה.

לפני תחילת הבדיקה, נקו את מכסה המנוע עם 70% אתנול, וחממו את מדיום ה-DMEM ל-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, זרעו 100,000 תאים בכל מצב לתוך צלחות של 6 בארות ב-DMEM מלא, ותרבית ב-37 מעלות צלזיוס.

לאחר 24 שעות, החליפו את המדיום הסופרנטנט במדיום ההסתיידות, ודגרו על התאים למשך 7 ימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, והחליפו את המדיום ביום השלישי.

לאחר 7 ימים, יש למדוד את ריכוז הסידן בצלחת של 96 בארות באמצעות מגיב Arsenazo III, ולרשום את הספיגה ב-650 ננומטר.