JoVE Encyclopedia of Experiments
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 4:57 דק' • July 8th, 2025
בדגי הזברה, חומר חלקיקי עדין בסביבה, או PM - מזהם אוויר - גורם לתפקוד לקוי של הלב הנגרמת על ידי מתח חמצוני.
כדי לחקור את ההשפעה של PM על דג הזברה, התחל בחשיפת עוברי דג הזברה לחומר אורגני שמקורו ב-PM, EOM, המעורר יצירת מיני חמצן תגובתיים, או ROS.
ROS מחמצן את בסיס ה-DNA גואנין ל-8-הידרוקסי-2′-דאוקסיגואנוזין או 8-OHdG וגורם לזרחון של היסטון H2AX ליצור γH2AX - סמן לשבירת גדיל כפול של DNA.
לאחר החשיפה, נתחו את לב דג הזברה והניחו אותו על מגלשת זכוכית. טפלו בלב בתמיסה מקבעת המקשרת בין החלבונים, ומייצבת את המבנה התאי.
לאחר מכן, הוסף מגיב חוסם כדי למנוע אתרי קשירה לא ספציפיים. הוסף נוגדנים ראשוניים המכוונים ל-γH2AX ו-8-OHdG בתאי הלב.
לאחר מכן, הוסף שני נוגדנים משניים בעלי תווית פלואורסצנטית בצבעים שונים הנקשרים באופן ספציפי לאזור ה-Fc של הנוגדן הראשוני שלהם. לבסוף, צבעו את הדגימה ב-DAPI - כתם ספציפי ל-DNA - שנקשר לחריץ הקטן של רצפים עשירים ב-AT ב-DNA ליצירת קומפלקס פלואורסצנטי.
הנח את השקופית מתחת למיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לצפות באותות מביטוי 8-OHdG ו-γH2AX בלבבות של עוברי דג הזברה שטופלו ב-EOM.
עוצמת פלואורסצנטיות גבוהה משמעותית מתאי הלב מצביעה על נזק חמצוני ל-DNA המושרה על ידי EOM ושברים דו-גדיליים.
השתמש בעט מחסום הידרופובי כדי לצייר עיגול על מגלשת זכוכית נקייה. הוסף 50 מיקרוליטר של 4% פרפורמלדהיד ל-1.25 מיקרוליטר PBS כדי ליצור תמיסה מקבעת. לאחר מכן, הניחו שלושה לבבות מנותחים במעגל מחסום הידרופובי אחד, ודגרו במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
שפכו את התמיסה מתחת למיקרוסקופ, וייבשו את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות לפחות. שטפו את השקופיות שלוש פעמים ב-PBST, למשך 5 דקות לכל כביסה. הוסף 50 מיקרוליטר BSA ל-1,000 מיקרוליטר PBST כדי לקבל תמיסת BSA של 5%, ודגר את השקופיות בתא לח למשך שעה אחת כדי לחסום קשירת נוגדנים לא ספציפיים.
שפכו את התמיסה ושטפו את הדגימות שלוש פעמים עם PBS למשך 5 דקות לכל כביסה. יש לדלל שני מיקרוליטרים של נוגדן חד-שבטי של עכבר כנגד 8-הידרוקסי-דאוקסיגואנוזין, ושני מיקרוליטרים של נוגדן רב-שבטי של ארנב כנגד גמא-H2AX ב-296 מיקרוליטר של PBST, כדי לקבל תמיסת קוקטייל נוגדנים ראשונית עובדת.
דגרו את דגימות הלב עם 50 מיקרוליטר של תמיסת קוקטייל הנוגדנים העיקרית, בתא לח למשך שעה לפחות בטמפרטורת החדר או לילה ב-4 מעלות צלזיוס.
שפכו את התמיסה, ושטפו את הדגימות שלוש פעמים עם PBST למשך 5 דקות לכל כביסה. יש לדלל 1 מיקרוליטר של נוגדן משני נגד עכברים לעזים המסומן ב-FITC, ו-1 מיקרוליטר של נוגדן משני נגד ארנב עז cy3 ב-500 מיקרוליטר PBST כדי לקבל תמיסת קוקטייל נוגדנים משנית עובדת.
דגרו את הדגימות עם הנוגדנים המשניים למשך שעה בטמפרטורת החדר בחושך.
שפכו את התמיסה ושטפו את הדגימות שלוש פעמים עם PBS למשך 5 דקות לכל כביסה. הוסף 20 מיקרוליטר של DAPI לדגימות לצביעה גרעינית, ודגר אותן למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. מרחו כיסוי על המגלשה, ואטמו אותה עם לק למניעת ייבוש ותנועה.
צלם את הדגימות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, וכמת את האות הפלואורסצנטי של אזור הלב באמצעות תוכנת ImageJ. חשב את השינויים היחסיים באמצעות ממוצע דגימות הבקרה של DMSO, וקבע את המובהקות הסטטיסטית של הנתונים.