אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 4:57 דק׳ • July 8th, 2025
בדגי הזברה, חומר חלקיקי עדין בסביבה, או PM - מזהם אוויר - גורם לתפקוד לקוי של הלב הנגרמת על ידי מתח חמצוני.
כדי לחקור את ההשפעה של PM על דג הזברה, התחל בחשיפת עוברי דג הזברה לחומר אורגני שמקורו ב-PM, EOM, המעורר יצירת מיני חמצן תגובתיים, או ROS.
ROS מחמצן את בסיס ה-DNA גואנין ל-8-הידרוקסי-2′-דאוקסיגואנוזין או 8-OHdG וגורם לזרחון של היסטון H2AX ליצור γH2AX - סמן לשבירת גדיל כפול של DNA.
לאחר החשיפה, נתחו את לב דג הזברה והניחו אותו על מגלשת זכוכית. טפלו בלב בתמיסה מקבעת המקשרת בין החלבונים, ומייצבת את המבנה התאי.
לאחר מכן, הוסף מגיב חוסם כדי למנוע אתרי קשירה לא ספציפיים. הוסף נוגדנים ראשוניים המכוונים ל-γH2AX ו-8-OHdG בתאי הלב.
לאחר מכן, הוסף שני נוגדנים משניים בעלי תווית פלואורסצנטית בצבעים שונים הנקשרים באופן ספציפי לאזור ה-Fc של הנוגדן הראשוני שלהם. לבסוף, צבעו את הדגימה ב-DAPI - כתם ספציפי ל-DNA - שנקשר לחריץ הקטן של רצפים עשירים ב-AT ב-DNA ליצירת קומפלקס פלואורסצנטי.
הנח את השקופית מתחת למיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לצפות באותות מביטוי 8-OHdG ו-γH2AX בלבבות של עוברי דג הזברה שטופלו ב-EOM.
עוצמת פלואורסצנטיות גבוהה משמעותית מתאי הלב מצביעה על נזק חמצוני ל-DNA המושרה על ידי EOM ושברים דו-גדיליים.
השתמש בעט מחסום הידרופובי כדי לצייר עיגול על מגלשת זכוכית נקייה. הוסף 50 מיקרוליטר של 4%
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים