בדיקת פצעים כדי להעריך את יכולת הנדידה של מיובלסטים מורינים בתרבות משותפת

בתגובה לפצע, תאים מפרישים מייצרים מולקולות איתות פרקריניות להפעלת מיובלסטים - תאי שריר לא ממויינים. מיובלסטים מופעלים נודדים לעבר אתר הפצע, שם הם מתרבים, וגורמים לפצע להחלים.

כדי להעריך את יכולת הנדידה של מיובלסטים במבחנה, קח צלחת מרובת בארות המכילה שכבה חד-שכבתית של מיובלסטים עכבריים. בעזרת קצה פיפטה, מגרדים את השכבה החד-שכבתית כדי ליצור טלאי ליניארי ונטול תאים בתוך הבאר, המדמה את אתר הפצע.

משלימים בזהירות את הבאר עם מדיום הגידול מבלי להפריע לתיקון הפצע.

קח תוספת קרומית המכילה תרבית דבוקה של תאי פסגה עצבית, או NCCs - תאי הפרשה - בתווך מתאים. הנח את התוספת בתוך הבאר, כך שה-NCCs בבסיס יהיו ליד מדבקת הפצע. דגירה של התרבות המשותפת למשך הזמן הרצוי.

במהלך הדגירה, ה-NCCs משחררים מולקולות איתות שנקשרות לקולטנים הספציפיים על המיובלסטים, ויוזמות מפל איתות. איתות זה מקל על ארגון מחדש של אקטין במיובלסטים, וכתוצאה מכך, תאים אלה מפתחים הקרנות ציטופלזמיות כגון lamellipodia ו-filopodia, בקצוות שלהם. הקרנות אלה מסייעות למיובלסטים לנדוד לעבר האזור הפצוע ולאכלס מחדש בהדרגה, מה שמוביל לריפוי פצעים.

הניחו את הצלחת מתחת למיקרוסקופ, והתבוננו בריפוי הפצע, שהיקפו מתואם עם יכולת הנדידה של מיובלסטים בתרבית משותפת.

כאשר התאים מגיעים למפגש של 70% עד 80%, הוציאו את המדיום העל-טבעי מתא ה-C2C12 היטב, ושטפו את התאים פעם אחת עם PBS.

לאחר הסרת ה-PBS, התחל לגרד את התאים על ידי העברת קצה פיפטה סטרילי P10 בחוזקה, בכיוון אחד כדי להשתרע על כל אורכו או רוחבו של התא חד-שכבתי. לאחר שרוטים את התאים, הוסף במהירות 1 מיליליטר PBS.

לאחר מכן, הפעל את המחשב ואת המיקרוסקופ. הנח את שקופית החדר על ה-stagה, וסובב את חוגת המטרה להגדלה פי 5. פתח את תוכנת ההדמיה, לחץ על הכרטיסייה "מצלמה" ולאחר מכן לחץ על כפתור "חי" כדי לדמיין את התאים בכרטיסייה "AxioCam IC".

ודא שמסנן האור נמשך עד הסוף כדי לאפשר לאור לעבור למצלמה ולמסך המחשב. הזז או סובב ידנית את מגלשת החדר כדי למקם את אזור הפצע במרכז התמונה החיה בכרטיסייה "AxioCam IC". כדי לצלם תמונות, לחץ על "הצמד" כדי לפתוח כרטיסייה "חדש" לצד הכרטיסייה "AxioCam IC" המכילה את התמונה.

כדי לשמור תמונת סטילס זו, לחץ על "קובץ", בחר "שמור בשם", בחר "שולחן עבודה" בסרגל משמאל כדי לשמור את הקובץ בשולחן העבודה. הזן את "שם הקובץ" בתיבה שם הקובץ, ושמור את האיור בפורמט קובץ ".czi".

כדי לשמור את התמונה כ".tiff", לחץ על "קובץ", בחר "שמור בשם", הזן את "שם הקובץ" בתיבת שם הקובץ, לחץ על כפתור "שמור כסוג" ובחר "*.tiff" מהתפריט הנפתח.

מקם מחדש ידנית את מגלשת התא כדי לצלם שתיים עד שלוש תמונות נוספות בנקודות אחרות של הפצע באותה באר. לאחר ההדמיה, הסר את ה- PBS מכל באר והוסף 1 מיליליטר של מדיום C2C12.

הרכיבו את מערכת ה-co-culture להכנסת באר על ידי הנחת ידנית של התוספות המכילות את תאי O9-1 בכל באר של החדר. בעדינות, דחף את התוספות כלפי מטה לתוך הבאר כך שתחתית התוסף יושבת ממש מעל תאי C2C12 הבסיסיים. החזר את מבני הכנסת הבאר לחממה, ואפשר לתאים לנדוד במשך 9 עד 12 שעות בסך הכל

.

כדי לקבוע את זמן הנדידה האופטימלי, בדוק את התאים שש שעות לאחר יצירת הפצע, ולאחר מכן כל שעתיים-שלוש לאחר מכן. סיימו את הניסוי כאשר התאים בתנאי ביקורת מכסים לחלוטין את הפצע.