אפיון מנגנוני ההתנגדות אוכלי עשב: Spittlebugs על Brachiaria Spp. כדוגמה

שלום, שמי Ush Bara ואני אנטומולוג במרכז הבינלאומי לחקלאות טרופית. המטרה הכללית היא להדגים בסרטון שיטה לאפיון מנגנוים של עמידות צמחי מאכסן לחרקים, כחלק ממאמצים משותפים ביוזמת ההכלאה שלנו לשיפור העמידות לפשפשי רשת (spit bug). דגשאיים (grasses) ישמשו כדוגמה במקרה זה.

פשפשי הרוק הם מזיקים חמורים של דגשנים רבים בעלי חשיבות כלכלית, כולל מרעות טרופיות, קנה סוכר ותירס. במרעות הטרופיות של אמריקה, צמחים השייכים לסוג gen bacteria הם המאכילים החשובים ביותר שלהם. צמח יכול לעמוד בפני נזקי עשבונייה באמצעות שלושה מנגנונים רחבים.

אנטיביוזיס (Antibiosis), אי-סבילות, המכונה לעיתים חוסר העדפה, היא המידה שבה הצמח נמנע כאשר בעל החיים הצמחוני מסוגל לבחור צמחים. אנטיביוזיס מזוהה בדרך כלל בניסויי בחירה שבהם לבעלי החיים הצמחוניים ניתנת גישה ליותר מגנוטיפ אחד. אנטיביוזיס היא המידה שבה הצמח משפיע על הכשירות (fitness) של בעל החיים הצמחוני הניזון ממנו.

לבסוף, סובלנות (tolerance) היא המידה שבה הצמח יכול לעמוד בנזק שנגרם על ידי ה-HBO או לתקן אותו, מבלי לפגוע בצמיחתו וברבייתו של ה-HBO. הן אנטיביוטיקה והן סובלנות מזוהות בצורה הטובה ביותר בבדיקות ללא ברירה (no choice tests), שבהן ה-hbos מוגבלים ולכן נאלצים להזין מצמח יחיד. הסרטון שלנו ידגים בדיקה ללא ברירה שנועדה להעריך חוסר סובלנות לאנטיביוטיקה, spit bug IV. בעשבי שדה מסוג aria grasses, עמידות הצמח המאכיל היא טקטיקה מרכזית לניהול ה-spit bug.

עם זאת, עמידות המבוססת על אנטיביוטיקה חזקה עלולה ליצור לחצי ברירה עבור ביוטייפים של מזיקים וירולנטיים יותר. מאידך, עמידות המבוססת על סבילות תאפשר לאוכלוסיות של spit dog להמשיך לגדול עד שהמספרים יכריעו את הצמח. לפיכך, עמידות בת-קיימא עשויה לדרוש רמות מסוימות הן של אנטיביוטיקה והן של סבילות.

פרוטוקול זה ידגים כיצד להעריך את התרומה היחסית של כל אחד מהגורמים לעמידות של spit bug. גנוטיפים של Aria Aria הגיעו ממאגר הנבטים (germ Plasm Bank) של המרכז הבינלאומי לחקלאות טרופית. הצמחים הופקו רבייתיות מcutting של גבעול בודד, מצמחים בוגרים ששימשו כיחידות ניסוייות.

הייחורים נגזמים לאורך של 10 centimeters כדי להבטיח אחידות של חומר השתילה ולמנוע זיהום על ידי פתוגנים צמחיים. הייחורים נשטפים בתמיסת sodium HypoChlor בריכוז 3% למשך שתי דקות ולאחר מכן נשטפים ביסודיות במי ברז. כל ייחור נשתל בכ-36 grams של קרקע סטרילית בתוך צינור PVC שנאטם בחלקו התחתון באמצעות כוס קלקר ונסגר בעזרת תושבת PVC.

הייחור מוחזק במקומו על ידי טבעת ספוג המוצבת בפתח המרכזי של התושבת. הצמחים מקבלים דישון ויש לספק מים כדי לשמור על לחות קרקע נאותה. הצמחים יגדלו במשך חודש לפני החשיפה לחרקים, מה שמאפשר התפתחות של שורשים שטחיים המשמשים כאתרי הזנה עבור הזנת שורשים.

הפיכת הצמחים ב-NIMS של ביצת הרוק למשך שמונה ימים לפני ההדבקה מעודדת עוד יותר את צמיחת השורשים השטחיים, ובכך מתקנת חלקית הבדלים מולדים בארכיטקטורת השורשים. שלב זה דורש מקור אור מלאכותי, אותו אנו מספקים 24 שעות ביממה. צמחים עם מעט שורשים שטחיים או ללא שורשים שטחיים כלל.

לאחר מכן, טיפול היפוך זה מושמט מהניסוי. 30 ימים לאחר השתילה, כל צמח מזוהם בפני השטח של הקרקע באמצעות שש ביצי בוגרות שהושגו מקולוניות הציפוליים שלנו. כדי להקים קולוניות אלו, נאספים ציפוליים בוגרים מהשדה, מזוהים ברמת המין, ומוכנסים לכלובי גידול שבהם הם מקבלים עלווה של צמחי aria רגישים להזנה. הנקבות מטילות את ביציהן בקרקע הנמצאת במגש רדוד המוצב בתחתית הכלובים.

לאחר מספר ימים, תולה את הקרקע במים ומעבירה אותה דרך סדרה של נפות כדי לאסוף את הביצים. תליה של החומר המסונן בתמיסת מלח 30% גורמת לביצים הבשלות לצוף, בעוד ביצים שאינן בשלות נשארות על שאריות של חומר אורגני. כדי למנוע זיהום על ידי פתוגנים של חרקים, מחטאים את הביצים בתמיסת sodium hypochlorite 0.5% למשך חמש דקות ולאחר מכן שוטפים במים מזוקקים; רק ביצים בשלות הקרובות לבקיעה נבחרות להדבקה.

ניתן לזהות אותם על ידי נוכחות של שתי נקודות אדומות בחלק הקדמי המתאימות לעיני החרק. סימונים ורודים בחלק האחורי המתאימים לבטן החרק, וספירקולום (spiracle) פתוח לחלוטין. בקעה מוצלחת מאושרת ארבעה ימים מאוחר יותר, ובנקודה זו כל ביצה שלא בקעה מוחלפת בבלוק ביצים של ניאונט (neonate).

מבדיקת המושבה שלנו. הצמחים מסודרים בתכנון בלוקים מלאים אקראי עם שש חזרות. הניסוי מוערך כ-30 יום לאחר ההדבקה.

דירוג נזקי הצמח מספק הערכה של רמת הסבילות. בעוד שדירוג הישרדות חרקים מספק הערכה של יעילות האנטיביוטיקה. הנזק מדורג באמצעות סולם ויזואלי של אחת עד חמש, כאשר אחת מקבילה להיעדר נזק נראה וחמש מקבילה למות הצמח.

בתורו, נמדד ההישרדות על ידי ספירת החרקים המגיעים למבחנה הסופית שלהם או לשלב הבוגר. כדי לסווג מנגנוני עמידות, מומלץ להציג את התוצאות באמצעות תרשים פיזור, שבו הישרדות החרקים מופיעה על ציר ה-x והנזק לצמח על ציר ה-Y. העמידות עולה ככל שנעים מימין לשמאל.

מצד שני, הסבילות עולה ככל שנעים מלמעלה למטה. אנו מחשיבים צמחים כעמידים אם התגובה לאוכל העשב נמצאת בחציו התחתון של תרשים זה. אם תגובה זו נמצאת ברביע השמאלי, מנגנון העמידות הדומיננטי הוא אנטיביוטיקה.

אם התגובה נופלת על הרבע הימני, מנגנון העמידות הדומיננטי הוא סבילות. להלן דגימה מייצגת של נתוני הסריקה שלנו. הנקודות בחלק העליון מייצגות צמחים רגישים.

הנקודות ברביע השמאלי התחתון מייצגות צמחים העמידים הודות לאנטיביוטיקה. הנקודות ברביע הימני התחתון מייצגות צמחים העמידים הודות לסבילות. צפינו כעת בהדגמה של בדיקת "חוסר בחירה" (no choice assay) להערכת התרומות היחסיות של אנטיביוטיקה וסבילות לעמידות הצמחים בכל מקרה שבו הדבר פועל.

אנו משתמשים בעמידות של Aria לחרקי רוק כדוגמה, אך העקרונות המוצגים אמורים להיות רלוונטיים למערכות אחרות. אנו מקווים שהסרטון שלנו יעזור לכם במאמצים שלכם. בהצלחה.