בדיקת שביט לגילוי נזק לדנ"א בתאים

חשיפה לחומרים מזיקים גורמת לשברים חד-גדיליים ודו-גדיליים ב-DNA התאי, מה שמוביל לנזק ל-DNA.

כדי לזהות נזק ל-DNA, התחל עם תרחיף של תא בודד של תאים שטופלו בכימיקלים באגרוז נוזלי בעל נקודת התכה נמוכה. טען את התרחיף על מגלשת זכוכית, ואפשר לאגרוז להתמצק - מה שמאפשר קיבוע של תאים בתוך מטריצת הג'ל הנקבובית.

טפל בתאים עם מאגר ליזה. חומרי הניקוי במאגר מסיסים את הממברנות התאיות והגרעיניות, בעוד שהמלחים מסירים את ההיסטונים מה-DNA, ויוצרים גוף נוקלואיד המכיל DNA המחובר למטריצה הגרעינית.

דגרו את השקופיות במאגר אלקטרופורזה אלקליין. זה גורם ל-DNA להירגע וליצור שברים חד-גדיליים. הנח את השקופית במנגנון אלקטרופורזה, וחבר אותה לאספקת החשמל. זה מאפשר נדידה של DNA טעון שלילי לעבר האנודה החיובית.

ה-DNA הלא פגום נשאר מוגבל בתוך גוף הנוקלואיד. לעומת זאת, מקטעי הדנ"א הקטנים והפגומים מתחילים לנוע לעבר האנודה. התנועה הדיפרנציאלית הזו יוצרת מבנה דמוי שביט, שבו הדנ"א הלא פגוע יוצר את הראש, ואילו הדנ"א הפגוע יוצר את זנב השביט.

דגרו את המגלשה במאגר נטרול כדי לאפשר לשברי ה-DNA החד-גדיליים להתטבע מחדש. לאחר מכן, טפל בשקופית בצבע פלורסנט שמכתים את ה- DNA. דמיין את השקופית תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

עוצמת הזנב ואורכו נמצאים בקורלציה עם מידת הנזק ל-DNA התאי.

כדי להתחיל, הכינו נקודת התכה נמוכה של 0.6% ב- PBS, והניחו אותה באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. תייג את הקצה החלבי של השקופיות המצופות מראש עם שם, תאריך ומידע על הטיפול באמצעות טוש או עיפרון קבוע.

הניחו צלחת קירור על ספסל שטוח, והכניסו שתי חבילות קירור קפואות למגירת ההזזה מתחת למשטח המתכת. לאחר מכן, הניחו את השקופיות על צלחת הקירור לצינון מראש למשך 1 עד 2 דקות. צנטריפוגה והסר את הסופרנטנט מצינורות הדגימה, והניח אותם מיד בחזרה על הקרח. השעו מחדש את כדור התא עם 200 מיקרוליטר של 0.6% נקודת התכה נמוכה, וערבבו על ידי פיפטינג.

לאחר מכן, הוסף 80 מיקרוליטר של תאים המכילים אגרוז על שקופית צוננת, והניח במהירות כיסוי על הג'ל. הניחו לג'ל להתייצב על צלחת הקירור למשך 1 עד 2 דקות. בינתיים, הכינו 500 מיליליטר של תמיסת עבודה של מאגר ליזה, ושפכו אותו לכלי הליזיס.

לאחר שהג'לים התייצבו, הסר את החלקות הכיסוי במהירות על ידי החזקת השקופית בעדינות בין האגודל לאצבע, והחלקת הכיסוי מהג'ל. לאחר מכן, מקם את השקפים בתוך מנשא שקופיות, כאשר כל סימני הנקודות השחורים על השקפים פונים לאותו כיוון. הנח את מנשא ההחלקה בתוך צלחת הליזה. סגור את מכסה צלחת הליזיס והניח אותו לדגירה.

הסר בזהירות את מנשא השקופיות מכלי הליזיס מבלי להפריע לג'לים. בעדינות, הנח את מנשא ההחלקה בכלי כביסה טעון מראש במים מזוקקים כפולים קרים כקרח. ודא שהשקופיות שקועות לחלוטין, והשאיר את ההגדרה למשך 30 דקות.

הנח חבילת קירור קפואה מתחת למיכל האלקטרופורזה כדי לשמור על טמפרטורת חיץ אופטימלית. לאחר מכן, הוסף תמיסת עבודה של אלקטרופורזה קרה כקרח למיכל, והעביר לתוכו את מנשא ההחלקה. כוון את השקופיות, כך שהתא המכיל ג'לים יצביע לכיוון הקתודה.

דגרו את השקופיות במיכל האלקטרופורזה למשך 20 דקות, כדי לאפשר ל-DNA להירגע. לאחר מכן, הפעל את ספק הכוח כדי לבצע אלקטרופורזה למשך 20 דקות ב-1.19 וולט לסנטימטר. לאחר השלמת האלקטרופורזה, כבה את אספקת החשמל והסר את מנשא ההחלקה ממיכל האלקטרופורזה. אפשר למנשא ההחלקה להתנקז על נייר טישו למשך 30 שניות.

לאחר מכן, הניחו את מנשא השקופיות בכלי המכיל מאגר נטרול, והשאירו אותו למשך 20 דקות. לאחר מכן, הניחו אותו בכלי כביסה המכיל מים מזוקקים כפולים קרים כקרח, והשאירו אותו למשך 20 דקות. לאחר הכביסה, הסר את מנשא השקופיות מהמים, ואפשר לשקופיות להתייבש בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה.

כדי להחזיר לחות למגלשות, העבירו את מנשא השקופיות לכלי כביסה המכיל מים מזוקקים כפולים קרים כקרח והשאירו אותו למשך 30 דקות. לאחר מכן, הנח את מנשא השקופיות בכלי מכתים המכיל 2.5 מיקרוגרם לתמיסת יודיד פרופידיום מיליליטר.

סוגרים את מכסה הכלי המכתים, ודוגרים אותו למשך 20 דקות בחושך בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, העבירו את מנשא השקופיות לכלי נפרד, ושטפו אותו במים מזוקקים כפולים קרים כקרח למשך 20 דקות.

הסר את מנשא השקופיות מהצלחת, וייבש אותו לחלוטין בחושך, באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס או בטמפרטורת החדר. לאחר שהשקופיות מתייבשות לחלוטין, אחסן אותן בקופסת שקופיות בחושך עד שהן מוכנות לניתוח תמונה.