בדיקת ספיגת חומצות אמינו עם תווית רדיופונית לכימות ספיגה תאית של חומצות אמינו

מובילי חומצות אמינו הם חלבונים הקשורים לממברנה המתווכים העברת חומצות אמינו על פני קרומי התאים, ומווסתים תהליכים תאיים חיוניים.

כדי לחקור ספיגת חומצות אמינו במבחנה, קח תרבית של תאי סטרומה שמקורם במח עצם עכבר. שאפו את מצע הגידול. הוסיפו חוצץ מחומם מראש בתוספת גלוטמין - חומצת אמינו - המסומנת במימן רדיואקטיבי. דגירה למשך הזמן הנדרש.

המאגר שחומם מראש מספק טמפרטורה פיזיולוגית ו-pH מתאים הנדרש לספיגה תאית של גלוטמין. מובילי גלוטמין מורכבים מתחומי הובלה - האחראים על טרנסלוקציה של מצע באמצעות הובלה משותפת בצימוד יוני נתרן - ותחומי פיגומים מעוגנים בממברנה.

תחום ההובלה נקשר לגלוטמין עם תווית רדיו יחד עם יוני נתרן מהמאגר. עם הקשירה, הוא משחרר את המולקולות לתוך הציטופלזמה. במקביל, תחום ההובלה מעביר יוני נתרן תוך תאיים וחומצות אמינו ניטרליות מחוץ לתא, וכתוצאה מכך הומאוסטזיס תאי.

שטפו את התאים עם מאגר קר כקרח, סיימו את התגובה והסירו כל גלוטמין חוץ-תאי עם תווית רדיו. הוסף תמיסת חומר ניקוי. חומר הניקוי מבצע ליזה של התאים, וגורם לשחרור גלוטמין תוך-תאי.

צנטריפוגה הליזאט. הוסיפו את הסופרנטנט המכיל גלוטמין לבקבוקון עם קוקטייל נצנוץ, והניחו את הבקבוקון בתוך דלפק נצנוץ.

מולקולות הגלוטמין המסומנות ברדיו פולטות חלקיקי בטא בעלי אנרגיה גבוהה. המנצנצים בקוקטייל סופגים את החלקיקים ופולטים פולסי אור המזוהים על ידי מונה הנצנוץ.

מדוד את הרדיואקטיביות כדי להעריך את ספיגת הגלוטמין התאי.

כדי להתחיל בבדיקת ספיגת חומצות אמינו, צלחת 5 x 10⁴ תאי ST2, בכל באר של צלחת תרבית רקמה של 12 בארות במדיום אלפא-MEM בתוספת FBS, פניצילין וסטרפטומיצין. צלחת בארות נוספות של תאים כדי לכמת את מספר התאים לכל תנאי לנורמליזציה.

לאחר מכן, דגרו תאים בחממת תרבית תאים לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך יומיים-שלושה עד להתכנסות. לאחר הדגירה יש לשאוב את המדיום ולשטוף את התאים פעמיים עם מיליליטר אחד של PBS ב-pH 7.4. לאחר מכן, שאפו את ה-PBS לפני שטיפת התאים פעם אחת, עם מיליליטר אחד של Krebs Ringers HEPES, או KRH.

דגרו על תאים עם 0.5 מיליליטר של KRH טרי שהכיל ארבעה מיקרוקורי למיליליטר L-[3,4-3 H]-Glutamine Media למשך חמש דקות. לאחר הדגירה, אסוף את המדיום הרדיואקטיבי כדי להוציא למיכל הפסולת הנוזלית. לאחר מכן, שטפו את התאים שלוש פעמים עם KRH קר כקרח כדי לסיים את התגובה.

לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של נתרן דודציל סולפט 1% לכל באר, וטריטורציה של התערובת 10 פעמים כדי ליז ולהומוגניזציה של התאים. לאחר מכן, העבירו את הליזאטים של התא לצינור של 1.5 מיליליטר, והבהירו את הליזאט על ידי צנטריפוגה במהירות מינימלית של 10,000 גרם למשך 10 דקות.

העבירו את הסופרנטנט לבקבוקון נצנוץ, המכיל שמונה מיליליטר של תמיסת הנצנוץ, וקראו רדיואקטיביות בספירה לדקה באמצעות מונה נצנוץ.

משאר הלוחות הלא רדיואקטיביים של התאים, נסו את התאים, השעו מחדש וספרו את התאים כדי להעריך את מספר התאים בתרביות הרדיואקטיביות שעברו ליזה. בעזרת המוציטומטר, ספרו את מספר התאים לבאר לא רדיואקטיבית עבור כל מצב ניסוי.