בדיקה קולורימטרית לכימות לקטט בדגימות בדיקה

בתאים חיים, בתנאים אנאירוביים, האנזים לקטט דהידרוגנאז ממיר פירובט - תוצר סופי של גליקוליזה - ללקטט - מטבוליט מרכזי. כמות הלקטט המיוצרת בתאים משקפת את מצבם המטבולי.

כדי לכמת את ריכוז הלקטט התוך תאי, התחל עם דגימת בדיקה של ליזאט תאי נמטודה נטול חלבון. השלם בארות אחרות של צלחת מרובת בארות עם תמיסת לקטט בריכוזים ידועים שונים.

הליזט חסר את כל האנזימים החלבונים, כולל לקטט דהידרוגנאז אנדוגני, מה שמבטיח כימות מדויק של לקטט.

הוסיפו חוצץ לקטט לכל באר כדי לשמור על ה-pH המתאים לפעילות אנזימטית מיטבית. השלימו את הבארות עם תערובת תגובה המכילה את האנזים לקטט דהידרוגנאז, ניקוטינאמיד-אדנין דינוקלאוטיד - NAD - קו-אנזים, ובדיקה קולורימטרית ודגירה.

במהלך הדגירה, לקטט דהידרוגנאז מזרז את החמצון של לקטט תאי לפירובט, עם הפחתה בו זמנית של NAD ל-NADH. ה-NADH שנוצר מגיב עם הגשושית הקולורימטרית כדי לייצר מוצר סגול.

למדוד ספקטרוסקופית את הספיגה של התמיסה הסגולה עבור דגימת הבדיקה ותקני הלקטט ב-570 ננומטר. שרטט את ערכי הספיגה של תקני הלקטט וצור את עקומת הכיול.

לבסוף, השווה את ערך הספיגה של הדגימה לתקני הלקטט כדי לקבוע את כמות הלקטט הקיימת בדגימת הבדיקה.

כדי למדוד את ריכוז הלקטט, השתמש בערכת בדיקה קולורימטרית כדי לבצע ניתוח כפול עבור דגימות הבדיקה. הוסף 10 מיקרוליטר מדגימות הבדיקה לכל באר של צלחת של 96 בארות, ולא