JoVE Encyclopedia of Experiments
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 2:29 דק' • July 8th, 2025
ניתן להעריך את רמות הפירובט בתא - מתווך מרכזי במסלולים ביוכימיים לייצור אנרגיה - באמצעות מבחנים קולורימטריים מבוססי אנזימים.
כדי לקבוע את רמות הפירובט בתאים של Caenorhabditis elegans - נמטודה לא טפילית - קח חלק תאי שהוכן מתולעים בוגרות המכילות פירובאט. טפל בתמיסה, הסר חלבונים תאיים ואסוף את החלק התאי המובהר - דגימת הבדיקה - המכיל פירובאט. היעדר חלבונים תאיים מבטיח קביעה מדויקת של רמות הפירובאט.
התחל בהוספת מגיב עובד המכיל את האנזימים פירובט אוקסידאז וחזרת פרוקסידאז, וצבע כרומוגני. דגרו את התערובת בחושך למשך זמן מתאים.
במהלך הדגירה, פירובט אוקסידאז מגיב עם פירובט - המצע שלו - ויוצר מי חמצן כתוצר לוואי. היעדר אור מונע פירוק ספונטני של מי חמצן.
חזרת פרוקסידאז מזרזת את התגובה בין מי החמצן לצבע הכרומוגני, ומייצרת מוצר צבעוני. עוצמת תוצר התגובה הצבעונית עומדת ביחס ישר לריכוז הפירובט בדגימה.
עם סיום תקופת הדגירה, הנח את הדגימה בתוך קורא צלחות ומדוד את הספיגה. צור עקומה סטנדרטית באמצעות דילול סדרתי עם ריכוזי פירובט ידועים.
שרטט את ערך הספיגה הנמדד של דגימת הבדיקה על העקומה כדי לקבוע את ריכוז הפירובט בדגימת הבדיקה.
השתמש בערכת בדיקה קולורימטרית כדי למדוד את ריכוז הפירובט בדגימות הבדיקה, ובצע בדיקות דופלקס.
הוסף 10 מיקרוליטר מדגימות הבדיקה לבארות שונות של צלחת של 96 בארות, והוסף 90 מיקרוליטר של מגיב עובד לכל דגימה. דגירה מכוסה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הנח את הצלחת בקורא מיקרו-פלטות כדי למדוד את הספיגה של כל באר ב-570 ננומטר.
שרטט את העקומה הסטנדרטית של פירובט וחשב את ריכוזי הפירובט מהעקומה הסטנדרטית על ידי הכפלת כל ריכוז ב-2.25.
מאמר זה מתאר שיטה להערכת רמות תאיות של פירובט ב-Caenorhabditis elegans באמצעות בדיקות קולורימטריות מבוססות אנזימים. התהליך כולל הכנת פראקציה תאית, טיפול להסרת חלבונים ומדידת בליעה לקביעת ריכוז הפירובט.
מדידה כמותית של פירובט בפרקציות תאיות מאפשרת אפיין מטבולי מדויק במערכות מודל פרה-קליניות. בדיקה קולורימטרית זו תומכת בצוותי גילוי מוקדם על ידי אספקת נתונים אמינים וניתנים לשחזור על תוצרי ביניים מטבוליים, ובכך מסייעת בתיקוף מטרות ובניתוח מסלולים. כימות מדויק של פירובט מחזק את הביטחון החזוי לגבי מודולציה של מסלולים מטבוליים בתיקי מחקר תרגומיים.
בדיקה קולורימטרית זו של פירובט משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני, ותומכת הן בבחינה מוקדמת של השערות והן בתיקוף של מטרות מטבוליות בשלבים מאוחרים יותר.
סרטונים קשורים
0 צפיות
סרטונים קשורים
0 צפיות
סרטונים קשורים
0 צפיות
סרטונים קשורים
0 צפיות
סרטונים קשורים
0 צפיות
סרטונים קשורים
0 צפיות
סרטונים קשורים
0 צפיות
סרטונים קשורים
0 צפיות
סרטונים קשורים
0 צפיות
סרטונים קשורים
0 צפיות
עודכן לאחרונה: 29 אוגוסט 2026