בדיקה ספקטרופוטומטרית לקביעת פעילות גליקוגן סינתאז

גליקוגן סינתאז - אנזים חיוני בסינתזה של גליקוגן - מבקע גלוקוז אורידין דיפוספט, או UDP-גלוקוז - סוכר נוקלאוטיד - לשאריות UDP וגליקוזיל ומוסיף את מונומר הגלוקוז המשוחרר לשרשרת הגליקוגן הגדלה.

כדי להעריך את פעילות הגליקוגן סינתאז, התחל בנטילת תערובת תגובה המכילה גליקוגן, UDP-גלוקוז, ATP, פוספואנולפירובט וניקוטינמיד אדנין דינוקלאוטיד, או NADH, בשפופרת. הוסיפו נוקלאוזיד דיפוספט, או NDP, אנזים קינאז, וקוקטייל אנזים פירובט קינאז ולקטט דהידרוגנאז. ערבבו את התוכן ודגרו.

הוסף דגימה המכילה גליקוגן סינתאז לצינור כדי להתחיל את התגובה האנזימטית.

גליקוגן סינתאז פועל על UDP-גלוקוז, ויוצר UDP ושאריות גליקוזיל. האנזים לוקח את מונומר הגלוקוז החופשי ומשלב אותו בשרשרת הגליקוגן של תערובת התגובה. בנוכחות ATP, ה-NDP קינאז של תערובת התגובה מזרחן את ה-UDP שאינו בשימוש, ממיר אותו ל-UTP ויוצר ADP.

האנזים פירובט קינאז פועל על ADP ומוסיף פוספט שנתרם על ידי הפוספואנולפירובט של תערובת התגובה לייצור ATP ופירובאט. לאחר מכן, לקטט דהידרוגנאז ממיר את הפירובט ללקטט ומחמצן NADH במהלך התגובה.

מדוד את הירידה בספיגת NADH ב-340 ננומטר כדי לכמת את כמות ה-NADH הנצרכת, מה שמעיד על פעילות אנזימים מוצלחת.

כדי להתחיל בקביעת פעילות הגליקוגן סינתאז, יש להפשיר את תמיסות המלאי שהוכנו בעבר של UDP-גלוקוז, ATP, פוספואנולפירובט ו-NDP קינאז על קרח. מחממים אמבט מים ל -30 מעלות צלזיוס.

כאשר תמיסות המלאי מוכנות, הכינו תערובת בדיקה מספקת בהתאם למספר מבחני הגליקוגן סינתאז, על ידי הוספת הריאגנטים לצינור של 15 מיליליטר, כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

הכן תגובה ריקה על ידי החלפת ה- NADH מתערובת התגובה במים, והעביר את התגובה לקובט מתקרילט חד פעמי. השתמש בתגובה הריקה כדי להגדיר 'אפס' על הספקטרופוטומטר באורך גל של 340 ננומטר.

קח אליקוט אחד של 770 מיקרוליטר מתערובת התגובה בשפופרת של 1.5 מיליליטר, והוסף ברצף 2 מיקרוליטר כל אחד, של תערובת NDP קינאז ופירובט קינאז/לקטט דהידרוגנאז לשפופרת.

לאחר ערבוב עדין, דגרו את הצינור בחום של 30 מעלות צלזיוס באמבט המים, למשך 3 דקות כדי לחמם מראש את תערובת התגובה. לאחר מכן, הוסף 30 מיקרוליטר מהדגימה המכילה גליקוגן סינתאז, במאגר טריס של 20 מילי-מולרי ב-pH 7.8, וערבב בעדינות לפני העברת תערובת התגובה לקובטה חד פעמית של מתאקרילט.

הנח את הקובט בספקטרופוטומטר, ורשום את הספיגה ב-340 ננומטר במרווחי זמן קצובים למשך 10 עד 20 דקות. לאחר מכן, שרטטו את הספיגה המתקבלת כנגד הזמן.