JoVE Encyclopedia of Experiments
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 3:00 דק' • July 8th, 2025
במהלך זיהום בנגיף השפעת, הנגיף נכנס לתא דרך אנדוציטוזיס וחוטף את מנגנון התא המארח, ומייצר נגיפים צאצאים. אלה משתחררים, מדביקים תאים שכנים וגורמים למפל של זיהום.
כדי למדוד את היחס בין נגיף השפעת הזיהומית לתאים בתרבית - ריבוי הזיהום - הוסף צפיפות מתאימה של תרחיף תאי יונקים שהושג לאחרונה לתוך צלחת מיקרוטיטר.
הצלחת מכילה מיקרו-אלקטרודות זהב למדידת עכבה המוטבעות בתחתית הבאר. דגירה, המאפשרת לתאים להיצמד לקרקעית הבאר ולהגיע לשלב הצמיחה האקספוננציאלי לפני ההדבקה.
הפעל פוטנציאל חשמלי קטן בין המיקרואלקטרודות. תאים הנצמדים למיקרו-אלקטרודות פועלים כמבודדים, מגבילים את זרימת הזרם ומגבירים את ההתנגדות החשמלית - העכבה - הנמדדת.
הסר את המדיה. פיפטה השעיית נגיף השפעת לבארות. תוסף עם סרין אנדופרוטאז מתאים.
במהלך הדגירה, הסרין אנדופרוטאז מתבקע ומפעיל את הגליקופרוטאין הנגיפי המגלוטינין, מה שמקל על קשירתו לקולטני תאי מארח ספציפיים ולכניסת תאי הנגיף לאחר מכן.
באמצעות מנגנון התא המארח, חלקיקים נגיפיים חדשים מיוצרים ומשתחררים, ומדביקים תאים שכנים. כתוצאה מכך, התאים הנגועים בנגיף עוברים שינויים מורפולוגיים ומציגים השפעות ציטופתיות, מה שמוביל למוות של תאים - תאים מתנתקים משטח המיקרואלקטרודה, ומפחיתים את העכבה לאורך זמן.
קבע את הזמן שלוקח לעכבה להפחית למחצית מהעכבה הראשונית לפני הוספת הנגיף. מסגרת זמן קצרה יותר מצביעה על ריבוי גבוה יותר של זיהום נגיפי.
כדי לקבוע את המתאם בין ערכי CIT50 לריבוי הזיהום, לאחר תרבית 3 x 104 תאי MDCK מפוצלים טריים לכל דופן של לוחית המיקרוטיטר האלקטרונית למשך 24 שעות, שטפו את התאים פעמיים עם 100 מיקרוליטר של מדיום התפשטות וירוסים טרי לכל באר בכל שטיפה, והשתמשו בפיפטה חד ערוצית כדי להוסיף 100 מיקרוליטר של תרחיף ויראלי לכל באר.
לאחר הוספת כל דילולי הנגיף, טען בעדינות את הצלחת לכיס העריסה של המכשיר ב-35 מעלות צלזיוס, והתחל לנטר את עכבת התא כל 15 דקות למשך 100 שעות לפחות, כפי שהודגם.
לאחר שני מחזורי מדידות, לחץ כדי "להשהות" את המכשיר ולהוציא את לוחית ה-E מהעריסה. הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום התפשטות הנגיף בתוספת TPCK-טריפסין לכל באר, והחזיר את צלחת ה-E לכיס העריסה. לאחר מכן, התחל את הניתוח.