בדיקת קינטיקה הישרדותית מבוססת עכבה תאית להערכת הישרדות הנגיף

נגיפים נקשרים לקולטן התא המארח ומפנימים לאנדוזום. הממברנה האנדוזומלית מתמזגת עם הממברנה הנגיפית, ומשחררת תוכן ויראלי בתוך התא.

עם הגעתו לגרעין, הגנום הנגיפי מתמלל ל-mRNA ומאוחר יותר מתורגם ליצירת חלבונים ויראליים. הרכיבים הוויראליים נכנסים לציטופלזמה ומתאספים לוויריונים, שצובטים החוצה מהתא וגורמים להשפעות ציטופתיות - שינויים במורפולוגיה של התא המארח ומוות.

כדי להעריך את קינטיקה של הישרדות הנגיף על ידי מדידת עכבת תא מארח, קח צלחת מרובת בארות המצופה במיקרו-אלקטרודות למדידת עכבה בתחתיתה. הוסיפו תרחיף של תא מארח לבארות, ודגרו כדי לאפשר לתאים להיצמד למשטח האלקטרודה ולגדול.

לאחר מכן, קח תרחיפים נגיפיים שטופלו מראש עם עומסים נגיפיים שונים. טיפול במי מלח מספק לנגיף כלוריד, המייצר חומצה היפוכלורית שהורגת אותו - ומפחית את ההדבקה הוויראלית. הוסף את התרחיפים הוויראליים הללו לבארות שלהם.

מדוד את העכבה התאית - תופעה של התנגדות לזרימת הזרם החשמלי דרך האלקטרודות - על ידי התאים הדבקים.

נגיפים מדביקים תאי מארח דבקים ומשנים את המורפולוגיה שלהם, וגורמים לניתוק התאים המשתנים מהאלקטרודות. עם הזמן, ככל שיותר תאים נדבקים, העכבה התאית המתווכת על ידי התא המארח פוחתת.

שרטט את מדד התא, שהוא השינוי בעכבה עקב ניתוק תאים נגועים, לאורך זמן.

כדי להעריך את קינטיקה של הישרדות נגיף השפעת A, הוסף נתרן כלורי לריכוז סופי של 35 גרם לליטר במים מזוקקים, והוסף 900 מיקרוליטר מתמיסת המלח המתקבלת לצינורות קריו-צינורות של 2 מיליליטר. הוסף 100 מיקרוליטר מלאי ויראלי לכל קריוטיוב, והנח את הצינורות באינקובטור של 35 מעלות צלזיוס, לפרק הזמן הניסיוני המתאים.

יום לפני סיום הדגירה, זרעו 3 x 10⁴ תאי MDCK טריים מפוצלים ב-100 מיקרוליטר של מדיום התפשטות הנגיף לבאר, בצלחת מיקרוטיטר של 16 בארות, וחזרו על השלבים המאפשרים מדידת עכבת הרקע והתפלגות אחידה של התאים על קרקעית הבארות. לאחר מכן, גדלו את התאים במשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.

למחרת, שטפו את התאים פעמיים, ואז הדביקו את התאים ב-100 מיקרוליטר של הנגיף המזוקק במי מלח, מדולל 10 פעמים במדיום תרבית טרי, כפי שהודגם, ועקוב אחר עכבת התא כל 15 דקות למשך 100 שעות לפחות.