בדיקת חומרים תגובתיים חומצה תיוברביטורית להערכת עקה חמצונית בסרום אנושי

תאים מייצרים רמות נמוכות של רדיקלים חופשיים במהלך תהליכים מטבוליים.

במצבים פתולוגיים מתרחשת ייצור יתר של רדיקלים חופשיים, הגורם למתח חמצוני. רדיקלים חופשיים אלה תוקפים חומצות שומן רב בלתי רוויות בפוספוליפידים של קרום התא בתהליך הנקרא חמצון שומנים. זה יוצר תוצרי חמצון רעילים, כולל הידרופרוקסידים ליפידים ומאלונדיאלדהיד (MDA), הגורמים לנזק לממברנה ולמוות של תאים.

כדי לזהות מתח חמצוני בסרום אנושי במבחנה באמצעות בדיקת החומר המגיב לחומצה תיוברביטורית (TBARS), התחל בשפופרת המכילה סרום אנושי שטופל בתרכובת מעוררת חמצון. הסרום המטופל מורכב בעיקר מתוצרי חמצון שומנים - MDA והידרופרוקסידים ליפידים - יחד עם פוספוליפידים, ליפידים וחלבונים.

לאחר מכן, הוסיפו נתרן דודציל סולפט (SDS) וערבבו כדי להמיס את השומנים ולשחרר את ה-MDA. SDS מנטרל את כל החלבונים המזהמים. הוסיפו חומצה חומצית מתאימה, ואחריה חומצה תיוברביטורית חומצית (TBA). דגירה בטמפרטורה גבוהה.

בתנאים חומציים ובטמפרטורות גבוהות, מולקולות TBA מגיבות עם MDA, ויוצרות קומפלקס MDA-TBA יציב אדום-ורוד, הנקרא TBARS. דגירה על קרח כדי לעצור את התגובה ולייצב את הקומפלקסים הקיימים.

צנטריפוגה. אסוף והעביר את הסופרנטנט המכיל MDA-TBA לצלחת מרובת בארות. בעזרת קורא מיקרו-פלטות, מדוד את ספיגת המתחם.

ספיגה גבוהה יותר מצביעה על ריכוז גבוה של TBARS, מה שמעיד על רמות גבוהות יותר של תוצרי חמצון שומנים ומתח חמצוני בסרום.

סמן את צינורות הזכוכית עבור הדגימות שיש לנתח, ולאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר מהדגימה המוכנה לכל צינור. הוסף 200 מיקרוליטר של 8.1% SDS לכל דגימה, וסובב בעדינות את צינור הזכוכית בתנועה סיבובית לערבוב.

הוסף 1.5 מיליליטר של 3.5 מולארי נתרן אצטט לכל דגימה. לאחר מכן, הוסף 1.5 מיליליטר של תמיסת חומצה תיוברביטורית מימית של 0.8%. הביאו את הנפח הסופי בכל צינור ל -4 מיליליטר על ידי הוספת 700 מיקרוליטר מים נטולי יונים. מכסים היטב את צינורות הזכוכית, ומדגרים אותם בגוש חימום המוגדר ל 95 מעלות צלזיוס למשך שעה. מכסים את הצינורות בנייר אלומיניום למניעת עיבוי. לאחר מכן, הוציאו את הצינורות מהבלוק ודגרו אותם על קרח למשך 30 דקות.

לאחר הדגירה, צנטריפוגה את הדגימות והתקנים ב-1,500 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. העבירו 150 מיקרוליטר של סופרנטנט מכל צינור לבאר בצלחת של 96 בארות, והסירו את כל בועות האוויר בעזרת קצה פיפטה.

מדוד את ספיגת הדגימות ב-532 ננומטר. לאחר מכן, הפחיתו את קריאת הספיגה הממוצעת של הדגימות הריקות מכל קריאות הספיגה האחרות.

צור עקומה סטנדרטית והשתמש בה כדי לחשב ריכוזי דגימה לא ידועים.