העברת אנרגיית תהודה פורסטר שנפתרה בזמן לניטור זרחן חלבונים בתאים

זרחון של חלבונים תאיים מסוימים הוא מנגנון ויסות מרכזי המוביל להפעלתם או השבתתם.

כדי לפקח על זרחון חלבון ספציפי, קח צלחת תרבית המכילה תאים דבקים. טפל בתאים באמצעות ממריץ כדי לקדם את זרחון החלבונים בתאים. שאפו את המדיום המושקע, והוסיפו מאגר ליזה תאים וקוקטייל מעכב פוספטאז.

רכיבי החיץ גורמים לליזה של תאים, ומשחררים את התוכן הסלולרי יחד עם חלבונים זרחניים ולא זרחניים. קוקטייל המעכב מנטרל פוספטאז תאי, כך שהחלבונים הזרחניים נשארים שלמים.

העבירו את ליזאט התא ללוחית זיהוי בנפח נמוך. טפל בליזאט עם הנוגדנים התורם והמקבל המחוברים לפלואורופורים רגישים לאור שונים.

במהלך הדגירה, הנוגדנים התורמים מזהים אפיטופ ספציפי על חלבון הבדיקה, ומאפשרים להם לקשור את הגרסאות הזרחניות והלא זרחניות של החלבון. לעומת זאת, הנוגדנים המקבלים נקשרים אך ורק לצורה הזרחנית של חלבון הבדיקה.

קשירה זו מביאה את הפלואורופור המקבל ליד הפלואורופור התורם בגרסאות החלבון הזרחני. קרבה זו מפעילה העברת אנרגיית תהודה של פורסטר, או FRET - תופעת העברת אנרגיה תלוית מרחק בין שני פלואורופורים רגישים לאור.

קרא את הלוח בקורא מיקרו-פלטות תואם FRET.

בתאורה, הפלואורופורים התורמים מתרגשים; זה מפעיל העברת אנרגיה למולקולות המקבלות, הפולטות אות פלואורסצנטי ארוך טווח המתואם עם רמת זרחון חלבון הבדיקה בתאים.

כדי לבצע את הבדיקה, יש להוציא 50 מיקרוליטר