בדיקה מבוססת Luminescence להערכת רעילות עצבית של תרכובות בדיקה על נוירונים

צמיחת נויריט - שבה נוירונים מפתחים הקרנות - חיונית לתפקוד עצבי והתחדשות.

כדי להעריך את ההשפעות הנוירוטוקסיות של תרכובות בדיקה מקדמות צמיחת נויריטים במבחנה, השג תא אב עצבי אנושי, hNPC, תרחיף באמצעי התמיינות.

זרעו את התאים לבארות צלחות מרובות בארות המצופות בפולי-L-ליזין ולמינין, מה שמקל על חיבור התאים לקרקעית הבאר ותומך בצמיחה תאית. מרכיבי אמצעי ההתמיינות מקדמים התמיינות hNPC לנוירונים.

טפל בקבוצה אחת של בארות עם תרכובת בדיקה מקדמת צמיחת נויריטים. זה מקיים אינטראקציה עם הנוירונים שמקורם ב-hNPC ועלול לגרום לצמיחת נויריטים, מבלי לשבש את תהליכי חילוף החומרים התאיים ואת הריכוז הבא של אדנוזין טריפוספט, ATP - מקור האנרגיה התאי העיקרי.

הוסף את המגיב החד-שלבי המכיל חומרי ניקוי, אנזים לוציפראז ומצע לוציפראז, מעכבי לוציפרין ו-ATPase יחד עם יוני מגנזיום, וערבב.

חומרי ניקוי משבשים את קרום התא, וכתוצאה מכך ליזיס תאים ושחרור ATP תוך תאי לתמיסה. מעכבי ATPase מעכבים את ה-ATPase האנדוגני המשתחרר, מה שעלול להפריע למדידת ATP. צנטריפוגה, משקעת פסולת תאים.

במהלך הדגירה, ה-ATP המשתחרר עם יוני מגנזיום גורם ללוציפרין להיקשר ללוציפראז, וכתוצאה מכך חמצון לוציפרין לאוקסילוציפרין נרגש מאוד, ופולט פוטון ביולומינסנט עם הרפיה למצב הקרקע שלו. בעזרת קורא מיקרו-פלטות, מדוד את הזוהר, המעיד על ריכוז ה-ATP.

ריכוז ATP גבוה יותר מייצג כדאיות תאים גבוהה יותר, מה שמצביע על כך שאין רעילות משמעותית של תרכובות בדיקה על נוירונים.

לציפוי הצלחת, הוסיפו 30 מיקרוליטר פולי-L-ליזין לכל באר של צלחת של 384 בארות, ודגרו את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך שעה. שטפו אותו פעמיים עם PBS, ותנו לו להתייבש כ-30 דקות.

הוסף 30 מיקרוליטר למינין לכל באר, ואז דגר את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. חזור על השטיפות עם PBS, והמשך בציפוי התאים. הוסף 20,000 נוירוספירות חד-תאיות ב-25 מיקרוליטר של אמצעי התמיינות, לכל באר של צלחת 384 הבארות, ודגירה על הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס למשך 5 ימים.

נדרשים כישורי פיפטינג ברמת דיוק גבוהה לציפוי המספר המדויק של נוירוספרות המפורקות לתאים בודדים. לכן, מומלץ להבדיל בין הנוירוספרות לנוירונים, לפני הציפוי כדי להשיג תוצאות הניתנות לשחזור יותר.

לאחר הדגירה מוסיפים 5 מיקרוליטר של תרכובת בדיקה לכל באר בריכוז פי 6 מהריכוז הרצוי, ודוגרים על התאים למשך 24 שעות נוספות.

כדי לבצע את בדיקת כדאיות התא, הוסף 30 מיקרוליטר של מגיב זוהר לכל באר, והשאיר את הצלחת על שייקר למשך 2 דקות. צנטריפוגה את הצלחת בחום של 300 עד 400 פעמים גרם למשך 30 שניות. לאחר מכן, דגרו את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות, והגנו עליה מפני אור. לאחר הדגירה, מדוד את הזוהר על קורא מיקרו-פלטות.