בדיקת Immunofluorescence להערכת ההשפעה של חלבוני מטרה על צמיחת נוירויט

נוירונים מתפתחים מרחיבים תהליכים ציטופלזמיים מגופי התאים שלהם על ידי צמיחת נויריטים לפיתוח דנדריטים ואקסונים, החיוניים לתקשורת בין נוירון לנוירון.

כדי לחקור את ההשפעה של חלבון מטרה על צמיחת נויריטים, קח צלחת מרובת בארות עם כיסוי מצופה פולי-D-ליזין בבסיסה. על פני השטח של הכיסוי יש תרבית דבוקה של נוירונים ראשוניים בקליפת המוח שמקורם במוח החולדה העוברי.

טפל בתאי העצב בתערובת המכילה שני סוגים של פלסמידים - פלסמיד EGFP המקודד חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר ופלסמיד שני המקודד את חלבון המטרה במגיב טרנספקציה מתאים.

מגיב הטרנספקציה מקל על כניסת הפלסמידים לתאים.

לאחר טרנספקציה, שני הפלסמידים מתבטאים ומייצרים חלבונים פלואורסצנטיים ירוקים וחלבוני מטרה. הביטוי של EGFP מעניק פלואורסצנטיות ירוקה לתאים שעברו טרנספטציה.

חלבוני מטרה בעלי פוטנציאל לגירוי צמיחת נויריט יוזמים איתות תאי, המקדם ארגון מחדש של שלד התא ומוביל להתפתחות הקרנות עצביות והרחבותיהן.

שאפו את המדיום המושקע, וקבעו את התאים עם פרפורמלדהיד. צביעת נגד התאים באמצעות נוגדנים חלבונים אנטי-מטרה מתויגים בצבע פלואורסצנטי אדום הקושרים באופן ספציפי חלבוני מטרה מבוטאים ומעניקים פלואורסצנטיות אדומה נוספת לתאים.

הסר את הכיסוי מצלחת התרבית, והתבונן בו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

תאים שעברו טרנספקט משותף המציגים אות פלואורסצנטי דו-צבעוני מראים תהליכים