בדיקת השלמת לוציפראז מפוצלת לזיהוי אינטראקציות חלבון-חלבון ספציפיות

0 views • 4:02 min • July 8th, 2025

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אינטראקציות חלבון-חלבון חיוניות לתפקודים תאיים חיוניים.

כדי לחקור את האינטראקציות בין חלבונים טרנסממברניים - חלבוני ממברנה המשתרעים על שכבת השומנים הדו-שכבתית של קרום התא, התחל בבארות של צלחת מרובת בארות המכילה תרבית תאי יונקים דביקה.

לאחר מכן, הוסף תמיסה המכילה חומר טרנספקציה מתאים וזוג פלסמידים לביטוי.

אחד הפלסמידים הביטוי מקודד חלבון טרנסממברני מעניין המאוחה למקטע הקטן והלא פונקציונלי של האנזים לוציפראז; הפלסמיד השני מקודד חלבון טרנסממברני שני מעניין המאוחה לשבר הגדול והלא פונקציונלי של האנזים לוציפראז.

דגרו את הצלחת. סוכן הטרנספקציה מקל על הספיגה התאית של פלסמידים הביטוי.

תאים שעברו טרנספטציה מוצלחת מבטאים את החלבונים הטרנסממברניים. האינטראקציה בין החלבונים הטרנסממברניים המבוטאים מביאה את השברים הקטנים והגדולים הפונים לציטופלזמה לקרבה, וגורמת להם להיקשר וליצור את אנזים הלוציפראז הפעיל.

החלף את המדיה בבארות במדיה נטולת סרום כדי למזער את זוהר הרקע. הוסף פורימזין - מצע לוציפראז חדיר לתאים - תמיסה. פורימזין נכנס לתאים, ובעקבותיו לוציפראז מחמצן את הפורימזין ויוצר זוהר בעוצמה גבוהה.

בעזרת קורא מיקרו-פלטות, מדוד את הזוהר, מה שמרמז על האינטראקציה החזקה בין החלבונים הטרנסממברניים.

קצרו את תרבית התאים HEK293T על ידי טריפסיניזציה, והשעו מחדש את התאים במצע גידול מלא ייעודי. צלחת את התאים על תחתית שקופה, צד לבן, צלחת 96 בארות. התאימו את המספר הכולל של הבארות כך שיתאימו לכל השילובים והבקרות שנבדקו, כולל שכפולים. לאחר מכן, תרבית התאים למשך הלילה בתנאים סטנדרטיים.

למחרת, העבירו את התאים עם השילובים הרצויים של פלסמידים לביטוי. לדלל את הפלסמידים במדיום נטול סרום ל-6.25 ננוגרם למיקרוליטר עבור כל מבנה, ולהוסיף את מגיב הטרנספקציה מבוסס השומנים ביחס מתאים של שומנים ל-DNA.

דגרו את הפלסמידים לפי הוראות היצרן. לאחר מכן, הוסף 8 מיקרוליטר מתערובת השומנים-DNA לבארות המיועדות לכך. מערבבים את תכולת הצלחת בסיבוב עדין, ומתרביים את התאים למשך 20 עד 24 שעות בתנאים סטנדרטיים.

למחרת, החלף את המדיום המותנה בכל באר ב-100 מיקרוליטר של מדיום נטול סרום, וודא שהתאים לא יתנתקו בעת החלפת המדיום.

רגע לפני מדידת הזוהר, ערבבו נפח אחד של פורימזין עם 19 נפחים של מאגר דילול. הוסף 25 מיקרוליטר מתמיסת העבודה של הפורימזין לכל באר, וערבב בעדינות את הצלחת ביד, או עם שייקר מסלולי.

הכנס את הצלחת לקורא מיקרו-פלטות זוהר, ויזן את הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס למשך 10 עד 15 דקות. בחר את הבארות לניתוח, וקרא זוהר עם זמן אינטגרציה של 0.3 שניות. המשך לעקוב אחר הזוהר עד שעתיים בעת הצורך.

10:20

שיטה לזיהוי מולקולה קטנה מעכבים של האינטראקציה בין החלבונים בין HCN1 ו TRIP8b

Related Videos

0 Views

05:51

בניית פלסמידים CRISPR וזיהוי יעילות נוקאאוט בתאים יונקים באמצעות מערכת כתב לוציפראז כפול

Related Videos

0 Views

07:31

מערכת חלקיקי קרום התא המקורי לניתוח אינטראקציה של חלבון-חלבון קרום

Related Videos

0 Views

04:29

טיהור זיקה דו-מולקולרית לבידוד שני חלבונים המקיימים אינטראקציה

Related Videos

0 Views

10:13

פלטפורמת הקרנה מבוססת לוציפראז Multiplexed לחקירת מלחמה בסרטן הקשורים להעברת אותות בתאים בתרבית

Related Videos

0 Views

11:46

חוקר חלבונים אינטראקציות בתאים חיים באמצעות העברת פליטת אור התהודה אנרגיה

Related Videos

0 Views

12:53

זיהוי של שותפי אינטראקציה חלבון בתאי יונקים באמצעות SILAC-immunoprecipitation פרוטאומיקה כמותי

Related Videos

0 Views

08:38

הקרנת הגנום כל חלבונים אינטראקציה ידי חלבון-בר השלמה Assay (PCA) בתאים חיים

Related Videos

0 Views

07:55

לוציפראז קומפלמנטציה הדמיה Assay העלים טבק benthamiana עבור Transiently קביעת חלבון אינטראקציה דינמיקה

Related Videos

0 Views

06:45

ויבתר חלבון רב מתחמי איתות על ידי טיהור זיקה קומפלמנטציה ריאקציה דו-מולקולרית (BiCAP)

Related Videos

0 Views

Last updated: 18 July 2026