אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 4:02 דק׳ • July 8th, 2025
אינטראקציות חלבון-חלבון חיוניות לתפקודים תאיים חיוניים.
כדי לחקור את האינטראקציות בין חלבונים טרנסממברניים - חלבוני ממברנה המשתרעים על שכבת השומנים הדו-שכבתית של קרום התא, התחל בבארות של צלחת מרובת בארות המכילה תרבית תאי יונקים דביקה.
לאחר מכן, הוסף תמיסה המכילה חומר טרנספקציה מתאים וזוג פלסמידים לביטוי.
אחד הפלסמידים הביטוי מקודד חלבון טרנסממברני מעניין המאוחה למקטע הקטן והלא פונקציונלי של האנזים לוציפראז; הפלסמיד השני מקודד חלבון טרנסממברני שני מעניין המאוחה לשבר הגדול והלא פונקציונלי של האנזים לוציפראז.
דגרו את הצלחת. סוכן הטרנספקציה מקל על הספיגה התאית של פלסמידים הביטוי.
תאים שעברו טרנספטציה מוצלחת מבטאים את החלבונים הטרנסממברניים. האינטראקציה בין החלבונים הטרנסממברניים המבוטאים מביאה את השברים הקטנים והגדולים הפונים לציטופלזמה לקרבה, וגורמת להם להיקשר וליצור את אנזים הלוציפראז הפעיל.
החלף את המדיה בבארות במדיה נטולת סרום כדי למזער את זוהר הרקע. הוסף פורימזין - מצע לוציפראז חדיר לתאים - תמיסה. פורימזין נכנס לתאים, ובעקבותיו לוציפראז מחמצן את הפורימזין ויוצר זוהר בעוצמה גבוהה.
בעזרת קורא מיקרו-פלטות, מדוד את הזוהר, מה שמרמז על האינטראקציה החזקה בין החלבונים הטרנסממברניים.
קצרו את תרבית התאים HEK293T על ידי טריפסיניזציה, והשעו מחדש את התאים במצע גידול מלא ייעודי. צלחת את התאים ע
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים