כתם נקודה כמותי להערכת חלבוני מטרה בליזט רקמה

כתם נקודה כמותי - או QDB - היא טכניקה שימושית לכימות ריכוז חלבוני המטרה בדגימה. לאחר שהדגימה משותקת על קרום פולימרי, ניתן לזהות את החלבונים באמצעות אימונובלוטינג.

כדי להתחיל, קח צלחת QDB - צלחת מרובת בארות עם קרום ניטרוצלולוזה המחובר לתחתית כל באר. הוסף את הדגימה - ליזאט רקמה המכיל את חלבון המטרה - במרכז הממברנה בתוך הבאר.

הניחו לדגימה להתייבש. חלבון המטרה נקשר לממברנה באמצעות אינטראקציות לא קוולנטיות.

הוסף פתרון חסימה. החלבונים בתמיסה נצמדים לאתרים הלא קשורים על הממברנה, ומונעים קשירה לא ספציפית של ריאגנטים לזיהוי.

לאחר מכן, הוסף תמיסה המכילה נוגדנים ראשוניים הנקשרים לחלבון המטרה בדגימה. יש לשטוף כדי להסיר נוגדנים לא קשורים.

לאחר מכן, הוסף תמיסת נוגדנים משנית. מולקולות אלה - המסומנות באנזים פרוקסידאז - נקשרות לנוגדנים הראשוניים הקשורים לחלבון. יש לשטוף כדי להסיר נוגדנים לא קשורים.

לבסוף, הוסף תמיסה המכילה מצע כימילומינסנט ומי חמצן. תוך שימוש במי חמצן, הפרוקסידאז הקשור לנוגדנים מחמצן את המצע ופולט אור. בעזרת קורא צלחות, מדוד את עוצמת הזוהר של הדגימה.

צור עקומת זוהר סטנדרטית באמצעות דילול סדרתי עם ריכוזים ידועים של חלבון המטרה. שרטט את ערך הזוהר הנמדד של הדגימה על העקומה כדי לקבוע את ריכוז חלבון היעד.

בהליך זה, הנח קופסת קצה פיפטה ריקה מתחת ללוחית ה-QDB כדי למנוע מהחלק התחתון של הצל