כתם נקודה כמותי להערכת חלבוני מטרה בליזט רקמה

כתם נקודה כמותי - או QDB - היא טכניקה שימושית לכימות ריכוז חלבוני המטרה בדגימה. לאחר שהדגימה משותקת על קרום פולימרי, ניתן לזהות את החלבונים באמצעות אימונובלוטינג.

כדי להתחיל, קח צלחת QDB - צלחת מרובת בארות עם קרום ניטרוצלולוזה המחובר לתחתית כל באר. הוסף את הדגימה - ליזאט רקמה המכיל את חלבון המטרה - במרכז הממברנה בתוך הבאר.

הניחו לדגימה להתייבש. חלבון המטרה נקשר לממברנה באמצעות אינטראקציות לא קוולנטיות.

הוסף פתרון חסימה. החלבונים בתמיסה נצמדים לאתרים הלא קשורים על הממברנה, ומונעים קשירה לא ספציפית של ריאגנטים לזיהוי.

לאחר מכן, הוסף תמיסה המכילה נוגדנים ראשוניים הנקשרים לחלבון המטרה בדגימה. יש לשטוף כדי להסיר נוגדנים לא קשורים.

לאחר מכן, הוסף תמיסת נוגדנים משנית. מולקולות אלה - המסומנות באנזים פרוקסידאז - נקשרות לנוגדנים הראשוניים הקשורים לחלבון. יש לשטוף כדי להסיר נוגדנים לא קשורים.

לבסוף, הוסף תמיסה המכילה מצע כימילומינסנט ומי חמצן. תוך שימוש במי חמצן, הפרוקסידאז הקשור לנוגדנים מחמצן את המצע ופולט אור. בעזרת קורא צלחות, מדוד את עוצמת הזוהר של הדגימה.

צור עקומת זוהר סטנדרטית באמצעות דילול סדרתי עם ריכוזים ידועים של חלבון המטרה. שרטט את ערך הזוהר הנמדד של הדגימה על העקומה כדי לקבוע את ריכוז חלבון היעד.

בהליך זה, הנח קופסת קצה פיפטה ריקה מתחת ללוחית ה-QDB כדי למנוע מהחלק התחתון של הצלחת לגעת במשטח השולחן. טען עד 2 מיקרוליטר מהדגימה למרכז הממברנה בתחתית יחידה בודדת של צלחת ה- QDB.

לעולם אל תאפשר לתחתית לוחית ה-QDB לגעת במשטח כלשהו, בזמן הטעינה, ואל תעמיס יותר מדי לבאר אישית. אתה חווה לא יותר מ -4 מיקרוליטר לבאר.

לאחר מכן, השאירו את צלחת ה-QDB הטעונה למשך שעה בטמפרטורת החדר, או השאירו את הצלחת העמוסה ב-37 מעלות צלזיוס למשך רבע שעה בחלל מאוורר היטב. כדי לחסום את הצלחת, טבלו את צלחת ה-QDB במאגר ההעברה ונערו אותה בעדינות למשך 10 שניות.

לאחר מכן, שטפו את צלחת ה-QDB בעדינות עם TBST שלוש פעמים ולאחר מכן שטפו את הצלחת במשך חמש דקות ב-TBST תחת ניעור מתמיד. לאחר מכן, חסום את לוחית ה- QDB עם מאגר חוסם למשך שעה תחת טלטול מתמיד. כעת, יש לדלל את הנוגדן העיקרי במאגר החוסם בריכוז נבחר, ולהוסיף 100 מיקרוליטר ממנו לכל באר בודדת של צלחת רגילה של 96 בארות.

הכנס את צלחת ה-QDB לצלחת 96 הבארות, ודגר את הצלחות המשולבות למשך שעתיים בטמפרטורת החדר, או למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס תחת טלטול מתמיד. לאחר מכן, שטפו את הצלחת בעדינות עם TBST שלוש פעמים, לפני שהיא נשטפת ב-TBST שלוש פעמים - בכל פעם במשך חמש דקות תחת ניעור מתמיד.

לאחר מכן, יש לדלל את הנוגדן המשני במאגר החוסם בריכוז הנבחר ולהכניס 100 מיקרוליטר לכל באר של צלחת של 96 בארות. לאחר מכן, דגרו את צלחת ה-QDB בתוך הצלחת העמוסה של 96 בארות למשך שעה בטמפרטורת החדר תחת טלטול מתמיד. שטפו את צלחת ה-QDB בעדינות שלוש פעמים עם TBST, ולאחר מכן שטפו את הצלחת שלוש פעמים, חמש דקות כל אחת עם TBST תחת ניעור מתמיד.

לצורך כימות יש להכין את מצע ה-ECL ואת ה-aliquot לצלחת של 96 בארות ב-100 מיקרוליטר לבאר. לאחר מכן, הכנס את לוחית ה-QDB לתוך צלחת 96 הבארות למשך שתי דקות תחת טלטול מתמיד. לאחר מכן, הסר את צלחת ה-QDB מצלחת 96 הבארות ונער קצרות כדי להסיר את עודפי הנוזלים. לאחר מכן, הניחו את הצלחת על צלחת מיקרוטיטר לבנה. לאחר מכן, הפעל את קורא המיקרו-פלטות ובחר צלחת עם כיסוי בממשק המשתמש, לפני הנחת הלוחות המשולבים בתוך קורא המיקרו-פלטות לצורך כימות.