כתם מערבי כמותי להערכת רמות ביטוי חלבונים

כתמים מערביים כמותיים - טכניקה המבוססת על נורמליזציה כוללת של חלבון - שימושית לכימות רמות ביטוי חלבון היעד.

כדי להתחיל, טען ליזאט רקמות לבארות של ג'ל שיפוע פוליאקרילאמיד. הליזאט מכיל את חלבון המטרה, יחד עם חלבונים תאיים אחרים.

הפעל את הג'ל במתח מתאים להפרדה אלקטרופורטית של חלבוני הדגימה לאורך השיפוע. בסיום, הנח את הג'ל על גבי הממברנה הפולימרית של ערימת העברה.

הפעל זרם חשמלי כדי להעביר את החלבונים המופרדים על הממברנה. לאחר מכן, הניחו את הממברנה בכתם חלבון כולל פלואורסצנטי. מולקולות הצבע הטעונות בכתם נקשרות אלקטרוסטטית לכל החלבונים על הממברנה.

הוסף פתרון חסימה. החלבונים בתמיסה נקשרים לקרום, לפיכך. מניעת קשירה לא ספציפית של ריאגנטים לזיהוי. הוסף נוגדן ראשוני שנקשר רק לחלבון המטרה. לאחר מכן, הוסף נוגדן משני - המסומן בפלואורופור - שמתחבר לנוגדנים הראשוניים.

לרגש את הדגימה בלייזר. רשום את הקרינה הנפלטת ממולקולות הצבע של כתם החלבון הכולל והפלואורופורים הקשורים לנוגדנים באורכי הגל המתאימים להם.

כדי לחשב את ערך טעינת החלבון המנורמל, חלקו את אות החלבון הכולל של כל נתיב בערך הגבוה ביותר. חלקו את אות חלבון המטרה בערך הטעינה המנורמל המתאים כדי לקבוע את הביטוי היחסי של חלבון המטרה.

לצורך אלקטרופורזה, הגדר ג'ל שיפוע Bis-Tris יצוק מראש של 4 עד 12% במערכת תא האלקטרופורזה של הג'ל, והעמיס 3.5 מיקרוליטר של תקן חלבון לבאר. בעת שימוש בתקן פנימי לנורמליזציה בין ממברנות, טען כמות השווה לדגימות האחרות לשלוש הבארות הראשונות ליד סולם החלבון, וטען 30 מיקרוגרם מכל דגימה לבארות הנותרות. לאחר מכן, העבירו את הדגימות דרך ג'ל הערימה ב-80 וולט למשך 10 דקות ואחריו 150 וולט למשך 45 עד 60 דקות נוספות.

בסוף האלקטרופורזה, כדי להרכיב את ערימת ההעברה, הנח את ג'ל החלבון על הערימה התחתונה המכילה את קרום הפוליווינילידן דיפלואוריד ואחריו נייר הסינון. השתמש ברולר הספיגה כדי להסיר בועות אוויר, והנח את הערימה העליונה על החלק העליון של נייר המסנן, לפני שתגלגל את הערימה שוב כדי להסיר בועות אוויר.

העבירו את כל הערימה למכשיר ההעברה עם האלקטרודה בצד שמאל של המכשיר והניחו את ספוג הג'ל על גבי הערימה, כך שהספוג מיושר עם המגעים החשמליים המתאימים במכשיר.

לאחר סגירת המכסה, בחר והתחל את התוכנית המתאימה. בסיום התוכנית, חותכים את הממברנה לגודל הג'ל, ושוטפים את הממברנה החתוכה במהירות במים מזוקקים כפולים לפני שתמשיך עם כתם החלבון הכולל.

לקבלת צביעת חלבון כוללת, גלגל את הממברנה לצינור של 50 מיליליטר כשצד החלבון פונה פנימה וסמן את הממברנה עם 5 מיליליטר תמיסת כתם חלבון על רולר למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר במכסה אדים.

בתום הדגירה יש לשטוף את הממברנה במהירות עם 5 מיליליטר תמיסת כביסה, להחזיר את הצינור לזמן קצר לגלגלת בין השטיפות, ולאחר מכן שטיפה קצרה במים טהורים במיוחד. הוסף 3 מילימטרים של חיץ חוסם לממברנה, והחזיר את הממברנה לגלגלת למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. החלף את המאגר החוסם בנוגדנים העיקריים המעניינים בריכוז האופטימלי המתאים, ודגר את הממברנה על הרולר למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.

למחרת יש לשטוף את הממברנה 6 פעמים למשך 5 דקות עם 5 מיליליטר PBS טרי לכל שטיפה על הרולר בטמפרטורת החדר. לאחר הכביסה האחרונה, דגרו את הממברנה עם תמיסת הנוגדנים המשנית המתאימה על הרולר למשך שעה בטמפרטורת החדר ולאחר מכן 3 כביסות למשך 30 דקות לכל כביסה. לאחר הכביסה האחרונה, יבש את הממברנה והשתמש בנייר אלומיניום כדי לשמור על הממברנה מוגנת מפני אור.

לרכישת תמונה, הנח את הממברנה על הסורק כשצד החלבון פונה כלפי מטה ובחר את אזור הסריקה בתוכנה. לאחר מכן רכוש תמונות בשני הערוצים וייצא את התמונות לתוכנית ניתוח תמונה מתאימה.

הצג את ערוץ ה-700 ננומטר כדי להציג את תוצאת צביעת החלבון הכוללת, ובחר "ניתוח" וצייר מלבן כדי להגדיר את אזור העניין לנורמליזציה. לאחר מכן, העתק והדבק את אזור המלבן הראשון על כל דגימה בודדת כדי להבטיח שהאזור המוגדר יהיה בגודל זהה עבור כל הנתיבים שנותחו.

כדי לכמת את ריכוז החלבון בכל נתיב, העתק את התוצאות הן מכתם החלבון הכולל והן מהחלבון המעניין לתוכנית גיליון אלקטרוני, וקבע את אות כתם החלבון הכולל הגבוה ביותר. לאחר מכן חלקו כל ערך אות כתם חלבון כולל בערך זה כדי לקבל את ערך טעינת החלבון המנורמל, וחלקו את ערך האות של 800 ננומטר מכל דגימה בודדת בערך החלבון המנורמל המתאים לה כדי לחשב את יחס ביטוי החלבון היחסי בדגימות שונות.