כתם מערבי כמותי להערכת רמות ביטוי חלבונים

כתמים מערביים כמותיים - טכניקה המבוססת על נורמליזציה כוללת של חלבון - שימושית לכימות רמות ביטוי חלבון היעד.

כדי להתחיל, טען ליזאט רקמות לבארות של ג'ל שיפוע פוליאקרילאמיד. הליזאט מכיל את חלבון המטרה, יחד עם חלבונים תאיים אחרים.

הפעל את הג'ל במתח מתאים להפרדה אלקטרופורטית של חלבוני הדגימה לאורך השיפוע. בסיום, הנח את הג'ל על גבי הממברנה הפולימרית של ערימת העברה.

הפעל זרם חשמלי כדי להעביר את החלבונים המופרדים על הממברנה. לאחר מכן, הניחו את הממברנה בכתם חלבון כולל פלואורסצנטי. מולקולות הצבע הטעונות בכתם נקשרות אלקטרוסטטית לכל החלבונים על הממברנה.

הוסף פתרון חסימה. החלבונים בתמיסה נקשרים לקרום, לפיכך. מניעת קשירה לא ספציפית של ריאגנטים לזיהוי. הוסף נוגדן ראשוני שנקשר רק לחלבון המטרה. לאחר מכן, הוסף נוגדן משני - המסומן בפלואורופור - שמתחבר לנוגדנים הראשוניים.

לרגש את הדגימה בלייזר. רשום את הקרינה הנפלטת ממולקולות הצבע של כתם החלבון הכולל והפלואורופורים הקשורים לנוגדנים באורכי הגל המתאימים להם.

כדי לחשב את ערך טעינת החלבון המנורמל, חלקו את אות החלבון הכולל של כל נתיב בערך הגבוה ביותר. חלקו את אות חלבון המטרה בערך הטעינה המנורמל המתאים כדי לקבוע את הביטוי היחסי של חלבון המטרה.

לצורך אלקטרופורזה, הגדר ג'ל שיפוע Bis-Tris יצוק מראש של 4 עד 12% במערכת תא האלקטרופורזה של הג'ל, והעמיס 3.5 מיקרולי