כתם מערבי חד-תאי לקביעת הטרוגניות התא

אתרי דלקת מכילים תאי חיסון שונים, כולל מונוציטים, מקרופאגים ולויקוציטים.

כדי לזהות אוכלוסיית תאים הטרוגנית על ידי כתמים מערביים חד-תאיים, קח שבב ספיגה מיובש מראש, המורכב מג'ל פוליאקרילאמיד הניתן להפעלה פוטו-אקטיבית בדוגמת בלוקים. בכל בלוק יש מיקרו-בארות רבות. דפוס למספר בלוקים לוכד תאים מרובים במקביל.

הוסף תרחיף המכיל אוכלוסיית תאים הטרוגנית. מידות הבאר מאפשרות לתאים בודדים להתיישב. טבלו את השבב בתא אלקטרופורזה מלא במאגר מתאים. מולקולות הניקוי במאגר משבשות את קרום התא, ומשחררות תוכן תאי.

החל שדה חשמלי. החלבונים המשוחררים נודדים על פני הג'ל, ונפרדים לרצועות בגודל מובהק. שטפו את השבב עם מאגר כביסה כדי להסיר מולקולות שאינן קשורות במיוחד, והשאירו רק חלבונים תאיים, כולל חלבוני הסמן הרצויים.

חשוף את הג'ל לאור UV, מפעיל את פני השטח שלו ומשתק את החלבונים.

הוסף קוקטייל של נוגדנים ראשוניים הנקשרים במיוחד לחלבוני סמן ייחודיים לכל סוג תא, ויוצרים קומפלקסים של נוגדנים ראשוניים לחלבון. להוציא תערובת של נוגדנים משניים מתויגים פלואורסצנטיים, הקושרים את הנוגדנים הראשוניים שלהם, ומסמנים את חלבון הסמן הספציפי לתא.

הנח את השבב בסורק. מדוד את עוצמת הקרינה שהיא פרופורציונלית לרמת הביטוי של סמן החלבון המתאים הספציפי לתא בודד של תרחיף תא הדגימה.

לניתוח כתם מערבי חד-תאי, הוסף 1 מיליליטר של תרחיף חד-תאי מדולל לשבב כתם מערבי חד-תאי מיובש בתחתית צלחת פטרי בגודל 10 סנטימטרים. לאחר חמש עד חמש עשרה דקות, בדוק את השבב תחת מיקרוסקופ שדה בהיר. כ-15% עד 20% מהמיקרו-בארות צריכות להיות תפוסות על ידי תא בודד, ופחות מ-2% מהבארות צריכות להכיל שני תאים או יותר.

אם השבב נטען כהלכה, הטה את הכלי 45 מעלות ושטוף את השבב שלוש פעמים עם מאגר מתלה כדי להסיר תאים שלא נתפסו. לאחר הכביסה האחרונה, טען בזהירות את השבב לתא האלקטרופורזה של מכשיר מערבי חד-תאי עם צד הג'ל כלפי מעלה, וכסה את כל שבב הכתם המערבי החד-תאי עם מאגר ליזה/ריצה. התחל את ליזיס התאים והפעל את המכשיר בהתאם לפרמטרי הניסוי המתאימים.

בתום הריצה, שטפו את השבב בשתי שטיפות של 10 דקות עם מאגר כביסה טרי לכל שטיפה בטמפרטורת החדר. לאחר השטיפה השנייה, הוסף 80 מיקרוליטר מתמיסת הנוגדנים העיקרית המעניינת לתא בדיקת הנוגדנים והורד את צד ג'ל השבב כלפי מטה כך שתמיסת הנוגדנים תנדנד על פני השבב.

לאחר שעתיים בטמפרטורת החדר, שטפו את השבב שלוש פעמים במאגר כביסה ופעם אחת במים על שייקר. דגרו את השבב עם נוגדן משני מתאים למשך שעה בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור. בתום הדגירה, שטפו את השבב שלוש פעמים עם מאגר כביסה, וסובבו את השבב על ספינר שקופיות כדי להסיר את כל מאגר הכביסה שנותר.

כדי להפשיט את שבב הכתם המערבי החד-תאי, הנח מתלה צינורות של 50 מיליליטר באמבט מים של 60 מעלות צלזיוס כשהמים רק סנטימטר אחד מעל המתלה. במכסה אדים, הוסף 40 מיליליטר של מאגר הפשטה, ו-320 מיקרוליטר של בטא-מרקפטואתנול למיכל. מניחים את השבב בצלחת פטרי בגודל 10 ס"מ בתוך המיכל ואוטמים את המיכל עם פרפילם.

לאחר מכן, הנח את המיכל בתוך מתלה הצינור באמבט המים. לאחר 90 דקות, העבירו בזהירות את הצ'יפס לכלי פטרי חדש, ושטפו בקצרה את הצ'יפס פעם אחת עם מאגר כביסה לפני הוספת 15 מיליליטר של מאגר כביסה טרי לצלחת פטרי לשטיפה של 15 דקות על השייקר.