אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 3:35 דק׳ • July 8th, 2025
CD95 - קולטן מוות - נקשר לנוגדנים האגוניסטיים שלו, ומפעיל הרכבה של קומפלקס איתות מעורר מוות, או DISC - קומפלקס רב-חלבוני המגייס פרוקאספאז 8. ב-DISC, הפרוקספאז 8 מתעמעם ומעבד ליצירת תוצרי מחשוף ביניים שונים, ולבסוף, צורה פעילה היוזמת אפופטוזיס.
כדי לנתח עיבוד קספאז-שמונה באמצעות כתמים מערביים כימילומינסנטיים, קח ליזאט המכיל תוצרי מחשוף ביניים הקשורים ל-DISC של קספאז 8 בשפופרת. הוסיפו לכך נוגדנים נגד CD95 שנלכדו בחרוז A-agarose. הנוגדנים נגד CD95 נקשרים לרכיב ה-DISC - CD95, ויוצרים קומפלקסים של חלבונים.
טען את הדגימה על ג'ל SDS-polyacrylamide כדי להפריד את חומרי הביניים של Caspase 8 בגדלים שונים כרצועות נפרדות. הניחו את הג'ל על קרום סופג, והפעילו זרם חשמלי. חומרי הביניים של קספאז 8 יוצאים מהג'ל אל קרום הספיגה.
טפל בממברנה בתמיסה המכילה חלבון חוסם כדי להרוות את אתרי קשירת החלבון - ולמנוע קשירה לא ספציפית.
הוסף תמיסה של נוגדנים ראשוניים, הנקשרים למוצרי קספאז-שמונה באתר ספציפי.
הוסף נוגדנים משניים מתויגים באנזים הנקשרים באופן ספציפי לאזור ה-Fc המשלים של הנוגדן הראשוני ליצירת קומפלקס נוגדנים משני של תוצר מחשוף קספאז-שמונה.
הוסף מצע כימילומינסנט המגיב עם האנזים המצומד לנוגדנים המשני ופולט אור. עוצמת האור הנפלט מתואמת עם כמות תוצר המחשוף של קספאז-שמונה.
כדי לבצע את הכתם המערבי, הוסף 20 מיקרוליטר של מאגר טעינה פי 4 לחרוזים, וחמם ב-95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. במקביל, מחממים את פקדי הליזאט בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. טען את הליזאטים, המשקעים החיסוניים ותקן חלבון על ג'ל SDS של 12.5%, והפעל במתח קבוע של 80 וולט.
לאחר השלמת ריצת הג'ל, העבירו את החלבונים מג'ל ה-SDS לקרום ניטרוצלולוזה. לאחר השלמת ההעברה, הניחו את הממברנה המוכתמת בקופסה, ודגרו אותה למשך שעה בתמיסה חוסמת, תחת תסיסה עדינה. לאחר מכן, שטפו את הממברנה שלוש פעמים למשך 5 דקות עם PBST.
כדי לזהות את החלבונים, יש להוסיף את הנוגדן הראשוני הראשון בדילול המצוין לממברנה, ולדגור אותו למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס בתסיסה עדינה. למחרת, שטפו את הממברנה בשלוש שטיפות PBST של 5 דקות, ולאחר מכן דגרו את הממברנה עם 20 מיליליטר נוגדן משני עם ניעור עדין למשך שעה בטמפרטורת החדר.
שוטפים את הממברנה שלוש פעמים עם PBST שוב. לאחר השלכת שטיפת ה-PBST האחרונה, הוסף כ-1 מיליליטר של מצע מי חמצן חזרת לממברנה, וגלה את האות הכימולומינסנטי.