בדיקת כתם מערבי Chemiluminescent לעיבוד חלבונים
אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 3:35 דק׳ • July 8th, 2025
CD95 - קולטן מוות - נקשר לנוגדנים האגוניסטיים שלו, ומפעיל הרכבה של קומפלקס איתות מעורר מוות, או DISC - קומפלקס רב-חלבוני המגייס פרוקאספאז 8. ב-DISC, הפרוקספאז 8 מתעמעם ומעבד ליצירת תוצרי מחשוף ביניים שונים, ולבסוף, צורה פעילה היוזמת אפופטוזיס.
כדי לנתח עיבוד קספאז-שמונה באמצעות כתמים מערביים כימילומינסנטיים, קח ליזאט המכיל תוצרי מחשוף ביניים הקשורים ל-DISC של קספאז 8 בשפופרת. הוסיפו לכך נוגדנים נגד CD95 שנלכדו בחרוז A-agarose. הנוגדנים נגד CD95 נקשרים לרכיב ה-DISC - CD95, ויוצרים קומפלקסים של חלבונים.
טען את הדגימה על ג'ל SDS-polyacrylamide כדי להפריד את חומרי הביניים של Caspase 8 בגדלים שונים כרצועות נפרדות. הניחו את הג'ל על קרום סופג, והפעילו זרם חשמלי. חומרי הביניים של קספאז 8 יוצאים מהג'ל אל קרום הספיגה.
טפל בממברנה בתמיסה המכילה חלבון חוסם כדי להרוות את אתרי קשירת החלבון - ולמנוע קשירה לא ספציפית.
הוסף תמיסה של נוגדנים ראשוניים, הנקשרים למוצרי קספאז-שמונה באתר ספציפי.
הוסף נוגדנים משניים מתויגים באנזים הנקשרים באופן ספציפי לאזור ה-Fc המשלים של הנוגדן הראשוני ליצירת קומפלקס נוגדנים משני של תוצר מחשוף קספאז-שמונה.
הוסף מצע כימילומינסנט המגיב עם האנזים המצומד לנוגדנים המשני ופולט אור. עוצמת האור הנפלט מתואמת עם כמות תוצר המחשוף של קספאז-שמונה.
כדי לבצע את הכתם המערבי, הוסף 20 מיק
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים