כתם דרומי לזיהוי רקומבינציה הומולוגית בגנום תאי גזע עובריים של עכבר

כתמים דרומיים כוללים זיהוי רצפי DNA ספציפיים מתערובת DNA מורכבת באמצעות זיהוי מבוסס בדיקה.

כדי לזהות אירועי רקומבינציה הומולוגית או HR בתאי גזע עובריים של עכברים עם כתמים דרומיים, השג DNA גנומי מהתאים. דגירה עם אנזים הגבלה כדי לעכל את ה- DNA לשברים קטנים יותר.

טען את ה-DNA על ג'ל אגרוז. בצע אלקטרופורזה להפרדת שברים מבוססת גודל.

טפל בג'ל בתמיסה חומצית להסרת בסיסי פורין, ושחרר את ה- DNA הדו-גדילי, dsDNA. הוסף תמיסת דנטורציה אלקליין. ה-pH הגבוה משבש את קשרי המימן, ומפרק את ה-dsDNA המשוחרר ל-DNA חד-גדילי, ssDNA. דגירה עם תמיסה מנטרלת לנטרול ה- pH של הג'ל.

הרכיבו את מערכת ההעברה באמצעות ניירות ספיגה, קרום ניילון וג'ל מוערמים על גבי הממברנה. בצע את ההעברה. ssDNA עובר מהג'ל לקרום באמצעות פעולה נימית כלפי מטה.

להקרין את הממברנה בקרניים אולטרה סגולות, לקשר ולשתק את ה- DNA. הניחו את הממברנה בצינור המכיל תמיסת הכלאה. דגירה עם סיבוב, ציפוי הממברנה ומניעת קשירת בדיקה לא ספציפית.

לבסוף, דגרו את הממברנה עם מאגר ההכלאה המכיל בדיקות חד-גדיליות עם תווית רדיואקטיבית. הבדיקות נקשרות לאזורי DNA ספציפיים באמצעות השלמת רצף.

שוטפים את הממברנה, מסירים בדיקות לא קשורות. חשוף את הממברנה לצילומי רנטגן. רצועות נפרדות על הממברנה מבחינות בין אזורי DNA המכילים אירועי HR מאזורי בקרה.

עבור כל gDNA, מערבבים 30 מיקרו