כתם צפוני לזיהוי וכימות מיקרו-רנ"א ספציפי בתמצית RNA כוללת של רקמת צמח

מיקרו-רנ"א, miRNAs, הם רנ"א קטנים, חד-גדיליים, שאינם מקודדים. miRNA משתלב בקומפלקס רב-חלבוני ונקשר עוד יותר לרצפי mRNA משלימים כדי לווסת באופן שלילי את ביטוי הגנים.

כדי לזהות miRNA ספציפי מסך ה-RNA מרקמות הצמח, הוסף צבע טעון ג'ל המכיל צבעי מעקב ופורממיד - חומר דנטורציה של RNA. מחממים את הדגימה כדי לנטרל את ה-RNA ולמנוע היווצרות מבנה משני לפני אלקטרופורזה.

טען את הדגימה וסמני ה-RNA הסטנדרטיים לבארות של ג'ל פוליאקרילאמיד דה-נטורינג שהורכב מראש. הפעל אלקטרופורזה, המאפשרת הפרדה מבוססת גודל של שברי RNA.

העבירו את הג'ל על ניירות סינון רטובים מראש על קלטת אלקטרו-בלוטינג. יישר קרום ספיגת ניילון ספוג חוצץ מעל הג'ל. לאחר מכן, ערמו את ניירות הסינון הרטובים מראש. בצע אלקטרו-סבוטינג.

הזרם החשמלי גורם ל-RNA הטעון שלילית, כולל ה-miRNA, לנוע מהג'ל אל פני השטח של קרום הניילון הטעון חיובית. חשוף את הממברנה לאור אולטרה סגול; זה מקשר את ה-RNA לממברנה, ובכך מונע אובדן RNA.

דגרו את הממברנה במאגר הכלאה המכיל חומרים חוסמים התופסים את אתרי הקישור הלא ספציפיים כדי להפחית את רעשי הרקע.

הוסף בדיקת RNA אוליגונוקלאוטיד עם תווית רדיו משלימה ל-miRNA היעד כדי להיקשר אליו במיוחד. שוטפים את הממברנה עם חיץ, מסירים בדיקות לא קשורות.

השתמש במערכת הדמיית זרחן כדי לזהות ולכמת את עוצמות אות ההכלאה הרדיואקטיבית. האות ברזולוציה גבוהה מצביע על ביטוי miRNA ספציפי ברקמת הצמח.

הפסק את הריצה המוקדמת של הג'ל.

יש לשטוף היטב את הבארות לפני טעינת הדגימה כדי להסיר משקעי אוריאה בתוך הבארות. מחממים את דגימות ה-RNA התלויות ב-98 מעלות למשך דקה אחת. טען את הדגימות חמות לבארות באמצעות קצות נימיים. הימנע מהכנסת בועות אוויר.

טעינה מלאה של כל הדגימות והרכיבו את המכסה. יש להריץ את הג'ל בחום של 80 וולט למשך 3 שעות, או עד שהברומופנול הכחול פועל לחלוטין. השתמש בקרום ניילון טעון חיובי להעברה. חותכים אותו למידות צלחת הזכוכית. סמן את הממברנה בפינה השמאלית העליונה שלה. הניחו בעדינות את הממברנה על פני מי Milli-Q סטריליים. הקפד למקם את צד התווית כלפי מטה מול פני המים.

קח מגש נקי והכין כריך ג'ל להעברה חשמלית. הנח את הצד האפור של הקסטה כלפי מטה. יוצקים 1X TBE מעט מעל מפלס הקסטה. הרטיבו מראש את כרית הסיבים ב-1X TBE, וסחטו אותה כדי להסיר בועות אוויר. חותכים שתי פיסות נייר סופג לגודל כרית סיבים.

הרטיבו מראש פיסת נייר סופג ב-1X TBE, והניחו אותה מעל כרית הסיבים. הסר בועות אוויר על ידי גלגול פיפטה מפלסטיק על הנייר. הרטיבו מראש פיסת נייר סופגת נוספת ב-1X TBE אחד והניחו אותה על הקסטה. גלגול להסרת בועות אוויר. כעת מערך הכריך מוכן להעברה חשמלית.

לאחר השלמת האלקטרופורזה, הפסק את הריצה והסר את המכסה מהמכשיר. הסר את הקסטה הפועלת מההגדרה. הוצא את צלחות הזכוכית מהקסטה הפועלת.

הסר בזהירות את הג'ל מהמכלול. הנח אותו על נייר הספיגה כך שדגימת ה-RNA הראשונה שנטענה תהיה לכיוון ימין. טבלו בעדינות את הממברנה הספוגה מראש ב-1X TBE והניחו אותה מעל הג'ל הפונה כלפי מטה עם התווית. אל תאפשר לקרום ולג'ל להתייבש. מגלגלים בעדינות כדי להסיר בועות אוויר.

טובלים פיסת נייר סופגת אחת ב-1X TBE, ומניחים אותה על הממברנה. הסר בועות אוויר. הניחו פיסת נייר סופגת נוספת והסירו את בועות האוויר. השלם את הכריך על ידי הנחת כרית הסיבים מעל המכלול. סגור את הקסטה בחוזקה.

הנח את קלטת הטרנסבלוט במודול. מלאו את המיכל ב-1X TBE, pH 8.2, עד לסימן הספיגה. סגור את מכסה המכשיר והעביר ב -10 וולט למשך הלילה ב -4 מעלות או בחדר קר. שמור את ה-UV cross-linker מוכן והגדר אותו ל-1,200 ממש לפני השלמת ההעברה החשמלית.

לאחר השלמת ההעברה, הסר את הקסטה מהמודול. הניחו את המודעהamp קרום על דף A4 והניחו את הצד המסומן כלפי מעלה. קשר את ה-RNA לממברנה על ידי הקרנה באור UV של 254 ננומטר ב-120 מיליג'אול. ניתן לאחסן את הכתם המקושר ב-4 מעלות או להשתמש בו להכלאה.

תכנן בדיקה משלימה לחלוטין ל-RNA הקטן שיש לזהות, ותייג את הגשושית בקצה ה-5 הראשוני שלה באמצעות אנזים PNK, ושלב את הרכיבים כפי שמוצג. דגרו את תערובת התגובה בחום של 37 מעלות למשך 30 דקות.

לאחר 30 דקות של דגירה, השתמש בעמודות G-25 כדי להפריד בדיקות לא מסומנות מתערובת התגובה. לתיוג משופר של הגשושית, הכן את עמודת G-25 לפני השימוש. הניחו את הכתם כשצד ה-RNA פונה למעלה, בתוך בקבוק הכלאה. מערבבים במרץ את מאגר ההכלאה לפני השימוש. הוסף 10 מ"ל של מאגר הכלאה, והנח את בקבוק ההכלאה בתוך תנור הכלאה הנשמר ב-35 מעלות עם סיבוב.

בצע הכלאה מוקדמת למשך 20 עד 30 דקות. לאחר הכלאה מוקדמת, הוציאו את הבקבוק מהתנור. הוסף את הגשושית המסומנת למאגר ההכלאה בעדינות. ודא שלא נוצרות בועות אוויר. דוגרים את הכתם בתוך התנור בחום של 35 מעלות עם סיבוב למשך 12 שעות.

לאחר ההכלאה, הסר את מאגר ההכלאה מהבקבוק. בצע שטיפה מהירה של הכתמים באמצעות מאגר כביסה I. שלב זה מבוצע כדי להסיר עודף תמיסת הכלאה מהכתמים. יתר על כן, דגרו את הכתמים ב-35 מעלות למשך 30 דקות באמצעות מאגר כביסה I. בצע שטיפה נוספת באמצעות מאגר II ב-35 מעלות למשך 30 דקות.

לאחר שטיפת הכתם, הניחו אותו בתוך מכסה הכלאה, הסירו עודפי חיץ ואטמו אותו. הנח אותו בתוך קלטת, וחשוף אותו למסך הדמיית זרחן נטול קרינה למשך 12 שעות. זיהוי אות ההכלאה באמצעות Typhoon Biomolecular Imager וניתוח התוצאות באמצעות תוכנת ImageJ.