אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 8:51 דק׳ • July 8th, 2025
מיקרו-רנ"א, miRNAs, הם רנ"א קטנים, חד-גדיליים, שאינם מקודדים. miRNA משתלב בקומפלקס רב-חלבוני ונקשר עוד יותר לרצפי mRNA משלימים כדי לווסת באופן שלילי את ביטוי הגנים.
כדי לזהות miRNA ספציפי מסך ה-RNA מרקמות הצמח, הוסף צבע טעון ג'ל המכיל צבעי מעקב ופורממיד - חומר דנטורציה של RNA. מחממים את הדגימה כדי לנטרל את ה-RNA ולמנוע היווצרות מבנה משני לפני אלקטרופורזה.
טען את הדגימה וסמני ה-RNA הסטנדרטיים לבארות של ג'ל פוליאקרילאמיד דה-נטורינג שהורכב מראש. הפעל אלקטרופורזה, המאפשרת הפרדה מבוססת גודל של שברי RNA.
העבירו את הג'ל על ניירות סינון רטובים מראש על קלטת אלקטרו-בלוטינג. יישר קרום ספיגת ניילון ספוג חוצץ מעל הג'ל. לאחר מכן, ערמו את ניירות הסינון הרטובים מראש. בצע אלקטרו-סבוטינג.
הזרם החשמלי גורם ל-RNA הטעון שלילית, כולל ה-miRNA, לנוע מהג'ל אל פני השטח של קרום הניילון הטעון חיובית. חשוף את הממברנה לאור אולטרה סגול; זה מקשר את ה-RNA לממברנה, ובכך מונע אובדן RNA.
דגרו את הממברנה במאגר הכלאה המכיל חומרים חוסמים התופסים את אתרי הקישור הלא ספציפיים כדי להפחית את רעשי הרקע.
הוסף בדיקת RNA אוליגונוקלאוטיד עם תווית רדיו משלימה ל-miRNA היעד כדי להיקשר אליו במיוחד. שוטפים את הממברנה עם חיץ, מסירים בדיקות לא קשורות.
השתמש במערכת הדמיית זרחן כדי לזהות ולכמת את עוצמות אות ההכלאה הרדיואקטיבית. האות ברזול
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים