פוטומטריה המונית לחקר אינטראקציות אנטיגן-נוגדנים ברמת מולקולה אחת

כדי לזהות אינטראקציות אנטיגן-נוגדנים באמצעות פוטומטריית מסה, ראשית, יש לדגור את הריכוז הרצוי של אנטיגנים ונוגדנים מטוהרים לפרק הזמן הנדרש, מה שמקל על קשירת אנטיגן-נוגדנים. בהתבסס על הסטוכיומטריה של קשירת אנטיגן, אזורי הפרטופ של נוגדנים אלה יכולים להכיל מספר משתנה של אנטיגנים מחוברים.

זרימה בתמיסה המכילה את הנוגדנים החופשיים יחד עם קומפלקסי האנטיגן-נוגדנים דרך תא זרימה שהורכב מראש. אבטח את החדר על שלב המיקרוסקופ של פוטומטר מסה. לאחר מכן, כוון את קרן הלייזר דרך תא הזרימה להדמיה אופטימלית.

בהתאם למספר האנטיגנים המחוברים לכל נוגדן, המסה המולקולרית של הקומפלקסים משתנה. שינויים אלה במסה גורמים לקומפלקסים לפזר אור בצורה שונה.

קומפלקסים בעלי מסה מולקולרית גבוהה יותר, שבהם שני אנטיגנים קשורים לשני הפרטופים של נוגדן יחיד, מפזרים יותר אור בהשוואה לקומפלקסים המכילים אנטיגן בודד. בנוסף, נוגדנים חופשיים מראים את הכמות הנמוכה ביותר של פיזור אור.

גלאי אוסף את האור המפוזר ומודד את תדירותו ועוצמתו. הפוטומטר מתעד תנודות באור המפוזר כתבנית התאבכות, ומייצג זאת ככתמים.

כתמים קלושים מתאימים לנוגדנים חופשיים. לעומת זאת, כתמים כהים מאוד מייצגים קומפלקסים עם שני אנטיגנים, והכתם הכהה פחות מכיל אנטיגן אחד קשור.

נוכחותם של כתמים כהים תואמת את האינטראקציות בין אנטיגן לנוגדנים.

כדי להעריך את הזיקה של נוגדנים-אנטיגן על ידי פוטומטריית מסה, מרחו טיפה של שמן טבילה במיקרוסקופ על מטרת המכשיר, והניחו את תא הזרימה על שלב המיקרוסקופ. הוסף 10 מיקרוליטר PBS מסונן לקצה אחד של תעלת תא הזרימה. המאגר ייכנס לתעלה בפעולה נימית.

בכרטיסייה בקרת מיקוד של תוכנת איסוף הנתונים, השתמש בלחצני התנועה הגסה של הבמה למעלה ולמטה כדי לבצע את ההתאמות הראשוניות, ולחץ על חדות כדי להציג את קריאת אות החדות. השתמש בלחצני הכוונון העדינים למעלה ולמטה כדי למקסם את ערך החדות, ולחץ על Set Focus ו-Lock Focus כדי להפעיל את פונקציית מעקב המיקוד. תמונה של שקופית נקייה צריכה לכלול ערך "אות" השווה ל- 0.05% או נמוך ממנו.

טען 20 מיקרוליטר מדגימת הנוגדן-אנטיגן הראשונה כפי שהודגם, ומחק את הנוזל מהקצה השני עם פיסת נייר סופגת קטנה. מיד עם הטעינה, לחץ על הקלט כדי לקבל את מספר הפריימים המתאים השווה ערך ל-100 שניות של נתונים. בסוף תקופת איסוף הנתונים, הזן שם קובץ עבור הנתונים ולחץ על אישור ולאחר מכן על דוגמה כדי לשמור את הקובץ.

כדי לנתח את נתוני הפוטומטריה ההמונית, פתח את הקובץ המעניין ולחץ על נתח. לחץ על טען כדי לטעון את פונקציית הכיול ולחץ על קובץ ושמור תוצאות בשם כדי לשמור את הנתונים שנותחו.

כדי לקבל את הריכוזים היחסיים של כל מין בדגימה, פתח את קובץ "eventsFitted.csv", העתק את הנתונים בעמודה M לתוכנת השרטוט והניתוח המתאימה, והשתמש בפונקציית העלילה/סטטיסטיקה/היסטוגרמה כדי לשרטט את התפלגות המסה המולקולרית. לחץ פעמיים על ההיסטוגרמה כדי לפתוח את חלון מאפייני העלילה, השבת את ה-binning האוטומטי ובחר גודל סל של 2.5 קילו-דלטון.

כדי ליצור את מרכזי הסלים ואת נתוני הספירה, לחץ על החל וצא. כדי להתאים את ההיסטוגרמה לפונקציות גאוסיות, בחר בעמודות מרכזי סלים וספירות ולחץ על פונקציות התפריט Analysis/Peaks ו- Baseline/Multiple Peak Fit. לחץ פעמיים כדי לציין את מיקומי השיא המשוערים בתרשים ההתפלגות ולחץ על פתח NLFit.

סמן את תיבות הסימון הקבועות עבור מרכזי "xc" והגדר את הערכים שלהם למסות המולקולריות הצפויות של הנוגדן החופשי וקומפלקסי האנטיגן-נוגדנים היחידים והכפולים. סמן את אפשרות השיתוף עבור פרמטרי הרוחב ולחץ על התאם.

ערכי גובה השיא המותאמים של הרכיבים הגאוסיים מייצגים את הריכוז היחסי של כל מין בדגימה. לאחר מכן, השתמש במשוואה כדי לחשב את חלק הריכוז של כל מין מערכי גובה השיא.